【摘要】目的：建立大腸桿菌和金黃色葡萄球菌細(xì)菌生物膜(BBF)的模型，考察注射用雙黃連對BBF形成的影響及抑制作用。方法：在特定的條件、方法下分別對細(xì)菌單獨(dú)培養(yǎng)和細(xì)菌與提取物共同培養(yǎng)，通過酶標(biāo)儀測量其OD值來考察BBF的生長能力。結(jié)果：注射用雙黃連對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌BDF的形成均有抑制作用。文章發(fā)表在《健康之路》上，是醫(yī)學(xué)論文發(fā)表范文，供同行參考。

　　【關(guān)鍵詞】雙黃連;細(xì)菌生物膜;影響

　　建立大腸桿菌和金黃色葡萄球菌細(xì)菌生物膜(BBF)的模型，考察注射用雙黃連對BBF形成的影響及抑制作用。

　　1　BBF模型的建立

　　1.1　大腸桿菌BBF模型的建立1.1.1　菌種的復(fù)活將大腸桿菌凍干粉加入0.4mlNB培養(yǎng)基溶解后，放入37℃恒溫振蕩器(230～240轉(zhuǎn)/分鐘)中培養(yǎng)8小時(shí)，分裝在離心管中，加入0.5ml的50%甘油，置于液氮中，于-80℃冰箱中冷藏保存。

　　1.1.2　大腸桿菌BBF模型建立的方法將置于-80℃冰箱中的大腸桿菌劃線于NB培養(yǎng)基的平板上，置于恒溫培養(yǎng)箱中，于36℃培養(yǎng)24小時(shí)。挑取平板上的單一菌落溶于5mlNB液體培養(yǎng)基中，于36℃恒溫振蕩器中振蕩8小時(shí)，得到單克隆細(xì)菌增殖培養(yǎng)的菌液，備用。

　　將菌液稀釋100倍置于96孔板中，四周為NB培養(yǎng)基作為空白。置于恒溫培養(yǎng)箱中，于36℃培養(yǎng)24小時(shí)，取出。將菌液傾出，用蒸餾水反復(fù)清洗后，加入0.1%結(jié)晶紫染色30分鐘后，將結(jié)晶紫傾出，洗凈，加入1%脫氧膽酸鈉溶液，30分鐘后，測其600nm處的OD值。以菌液濃度為橫坐標(biāo)，以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，考察BBF生長情況。

　　1.2　影響大腸桿菌BBF生長的因素通過實(shí)驗(yàn)的反復(fù)摸索，我們發(fā)現(xiàn)影響大腸桿菌BBF生長的因素主要有以下幾種：①菌種：不同的大腸桿菌菌株對BBF的影響很大，直接影響到BBF的生長與否和BBF形成的好壞。且大腸桿菌傳代越多，BBF的生長情況越不好，故我們每次實(shí)驗(yàn)均采用大腸桿菌的第二代菌株。

　　②96孔板的材質(zhì)：不同的細(xì)菌在不同材質(zhì)的96孔板上的生長情況是不同的。我們選用了市場上常見的三種96孔板分別是進(jìn)口聚氯乙烯(PVC)板，國產(chǎn)聚苯乙烯(PS)板，進(jìn)口聚苯乙烯板，大腸桿菌分別在不同材質(zhì)的96孔板上培養(yǎng)。結(jié)果，大腸桿菌在國產(chǎn)PS板上的生長情況是最好的。

　　③培養(yǎng)時(shí)間：考慮到實(shí)驗(yàn)操作時(shí)間的可行性，我們選定將大腸桿菌分別培養(yǎng)18小時(shí)、24小時(shí)、36小時(shí)，考察BBF的生長情況。結(jié)果，大腸桿菌在培養(yǎng)24小時(shí)后，BBF的生長情況最好。

　　1.3　金黃色葡萄球菌BBF的建立及影響因素金黃色葡萄球菌的BBF模型的建立方法基本上與大腸桿菌的相同。在這里就不做詳細(xì)的介紹。我們?nèi)耘f分別考察了96孔板的材質(zhì)、培養(yǎng)時(shí)間及菌液濃度等因素，最終確定金黃色葡萄球菌菌液稀釋100倍、于國產(chǎn)PS板上培養(yǎng)24小時(shí)，BBF的生長的最好且穩(wěn)定。

　　2　注射用雙黃連對BBF的影響

　　2.1　培養(yǎng)方法的建立我們建立兩種方法分別考察藥物對BBF形成的影響及對BBF的抑制作用。96孔板的點(diǎn)樣方法1：四周為菌液(NB培養(yǎng)基)。B行加入180μl菌液(NB培養(yǎng)基)，C～G行每孔各加入100μl菌液(NB培養(yǎng)基)，B行每孔用移液槍加入20μl藥液，混勻，用多通道移液槍從B行吸出100μl移入C行，混勻，再從C行吸出100μl移入D行，依此類推至H行，吸出100μl后，棄去。即從B～H行藥液濃度以2倍遞減。96孔板的點(diǎn)樣方法2：四周為菌液。B～G行加入100μlNB培養(yǎng)基，B行每孔用移液槍加入100μl藥液，混勻，用多通道移液槍從B行吸出100μl移入C行，混勻，再從C行吸出100μl移入D行，依此類推至H行，吸出100μl后，棄去。即從B～H行藥液濃度以2倍遞減。

　　培養(yǎng)方法一：考察對BBF形成的影響。

　　按“96孔板點(diǎn)樣方法1”完成后，依照“大腸桿菌BBF模型建立的方法”中置于恒溫培養(yǎng)箱中，于36℃培養(yǎng)24小時(shí)，以藥液濃度為橫座標(biāo)，以平均OD值為縱坐標(biāo)，作圖，考察對BBF形成的影響。

　　培養(yǎng)方法二：考察對BBF的抑制作用我們先將96孔板全部點(diǎn)菌液，依照“大腸桿菌BBF模型建立的方法”置于恒溫培養(yǎng)箱中，于36℃培養(yǎng)24小時(shí)，取出，此時(shí)BBF已經(jīng)形成，將菌液傾出，按“96孔板點(diǎn)樣方法”，將培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時(shí)，以藥液濃度為橫座標(biāo)，以平均OD值為縱坐標(biāo)，考察對BBF的抑制作用。

　　2.2　考察對BBF形成的影響

　　圖1注射用雙黃連對大腸桿菌BBF形成的影響

　　將注射用雙黃連加水溶解，配制成5mg/ml的藥液，分別進(jìn)行對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌培養(yǎng)的操作。注射用雙黃連對大腸桿菌BBF形成的影響結(jié)果見圖1所示。

　　3　討論

　　1)通過實(shí)驗(yàn)摸索，建立了可靠而穩(wěn)定的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌細(xì)菌生物膜(BBF)的模型，確定了影響因素。

　　2)96孔板清洗方法的摸索：96孔板的材質(zhì)是BBF模型能夠成功建立的重要因素，確定96孔板的清洗方法：先在96孔板內(nèi)加注洗液，浸泡3～5分鐘后，用手握持96孔板，甩干孔內(nèi)液體;再用乙醇浸泡24小時(shí)后超聲20分鐘，自然晾干，即可。

　　3)考察了注射用雙黃連對BBF形成的影響。得出注射用雙黃連對大腸桿菌及金黃色葡萄球菌BBF的形成均有明顯的抑制作用。

　　4　結(jié)語

　　本實(shí)驗(yàn)建立了可靠而穩(wěn)定的BBF模型，并通過此模型考察了中藥注射用雙黃連對BBF形成的影響，篩選出能夠抑制或破壞BBF形成的活性成分，為從中藥中開發(fā)治療慢性感染性疾病的新藥提供新的篩選模型，為科學(xué)、客觀評價(jià)中醫(yī)藥在治療慢性感染方面的作用提供了新的方法。

　　醫(yī)學(xué)論文發(fā)表須知：《健康之路》雜志創(chuàng)刊于2002年，是經(jīng)中華人民共和國新聞出版總署批準(zhǔn)的、由廣東省科學(xué)技術(shù)協(xié)會(huì)主管、中國保健協(xié)會(huì)與廣東省醫(yī)學(xué)會(huì)主辦的面向國內(nèi)外公開發(fā)行的健康科普類期刊，國際標(biāo)準(zhǔn)刊號(hào)：ISSN1671—8801，國內(nèi)統(tǒng)一刊號(hào)：CN44—1540/R，廣告經(jīng)營許可證：粵440000400123。《健康之路》是我國健康保健領(lǐng)域極具影響力與權(quán)威性的健康生活類雜志，是中共廣東省委保健辦公室指定刊物，是全國各省市處級以上領(lǐng)導(dǎo)優(yōu)先閱讀的具有保健前瞻性的重要刊物。2004年，《健康之路》被中國期刊協(xié)會(huì)評為“全國深受讀者喜愛的醫(yī)療科普雜志”。