【摘要】目的：建立大腸桿菌和金黃色葡萄球菌細菌生物膜(BBF)的模型，考察注射用雙黃連對BBF形成的影響及抑制作用。方法：在特定的條件、方法下分別對細菌單獨培養和細菌與提取物共同培養，通過酶標儀測量其OD值來考察BBF的生長能力。結果：注射用雙黃連對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌BDF的形成均有抑制作用。文章發表在《健康之路》上，是醫學論文發表范文，供同行參考。

　　【關鍵詞】雙黃連;細菌生物膜;影響

　　建立大腸桿菌和金黃色葡萄球菌細菌生物膜(BBF)的模型，考察注射用雙黃連對BBF形成的影響及抑制作用。

　　1　BBF模型的建立

　　1.1　大腸桿菌BBF模型的建立1.1.1　菌種的復活將大腸桿菌凍干粉加入0.4mlNB培養基溶解后，放入37℃恒溫振蕩器(230～240轉/分鐘)中培養8小時，分裝在離心管中，加入0.5ml的50%甘油，置于液氮中，于-80℃冰箱中冷藏保存。

　　1.1.2　大腸桿菌BBF模型建立的方法將置于-80℃冰箱中的大腸桿菌劃線于NB培養基的平板上，置于恒溫培養箱中，于36℃培養24小時。挑取平板上的單一菌落溶于5mlNB液體培養基中，于36℃恒溫振蕩器中振蕩8小時，得到單克隆細菌增殖培養的菌液，備用。

　　將菌液稀釋100倍置于96孔板中，四周為NB培養基作為空白。置于恒溫培養箱中，于36℃培養24小時，取出。將菌液傾出，用蒸餾水反復清洗后，加入0.1%結晶紫染色30分鐘后，將結晶紫傾出，洗凈，加入1%脫氧膽酸鈉溶液，30分鐘后，測其600nm處的OD值。以菌液濃度為橫坐標，以OD值為縱坐標，考察BBF生長情況。

　　1.2　影響大腸桿菌BBF生長的因素通過實驗的反復摸索，我們發現影響大腸桿菌BBF生長的因素主要有以下幾種：①菌種：不同的大腸桿菌菌株對BBF的影響很大，直接影響到BBF的生長與否和BBF形成的好壞。且大腸桿菌傳代越多，BBF的生長情況越不好，故我們每次實驗均采用大腸桿菌的第二代菌株。

　?、?6孔板的材質：不同的細菌在不同材質的96孔板上的生長情況是不同的。我們選用了市場上常見的三種96孔板分別是進口聚氯乙烯(PVC)板，國產聚苯乙烯(PS)板，進口聚苯乙烯板，大腸桿菌分別在不同材質的96孔板上培養。結果，大腸桿菌在國產PS板上的生長情況是最好的。

　　③培養時間：考慮到實驗操作時間的可行性，我們選定將大腸桿菌分別培養18小時、24小時、36小時，考察BBF的生長情況。結果，大腸桿菌在培養24小時后，BBF的生長情況最好。

　　1.3　金黃色葡萄球菌BBF的建立及影響因素金黃色葡萄球菌的BBF模型的建立方法基本上與大腸桿菌的相同。在這里就不做詳細的介紹。我們仍舊分別考察了96孔板的材質、培養時間及菌液濃度等因素，最終確定金黃色葡萄球菌菌液稀釋100倍、于國產PS板上培養24小時，BBF的生長的最好且穩定。

　　2　注射用雙黃連對BBF的影響

　　2.1　培養方法的建立我們建立兩種方法分別考察藥物對BBF形成的影響及對BBF的抑制作用。96孔板的點樣方法1：四周為菌液(NB培養基)。B行加入180μl菌液(NB培養基)，C～G行每孔各加入100μl菌液(NB培養基)，B行每孔用移液槍加入20μl藥液，混勻，用多通道移液槍從B行吸出100μl移入C行，混勻，再從C行吸出100μl移入D行，依此類推至H行，吸出100μl后，棄去。即從B～H行藥液濃度以2倍遞減。96孔板的點樣方法2：四周為菌液。B～G行加入100μlNB培養基，B行每孔用移液槍加入100μl藥液，混勻，用多通道移液槍從B行吸出100μl移入C行，混勻，再從C行吸出100μl移入D行，依此類推至H行，吸出100μl后，棄去。即從B～H行藥液濃度以2倍遞減。

　　培養方法一：考察對BBF形成的影響。

　　按“96孔板點樣方法1”完成后，依照“大腸桿菌BBF模型建立的方法”中置于恒溫培養箱中，于36℃培養24小時，以藥液濃度為橫座標，以平均OD值為縱坐標，作圖，考察對BBF形成的影響。

　　培養方法二：考察對BBF的抑制作用我們先將96孔板全部點菌液，依照“大腸桿菌BBF模型建立的方法”置于恒溫培養箱中，于36℃培養24小時，取出，此時BBF已經形成，將菌液傾出，按“96孔板點樣方法”，將培養基培養24小時，以藥液濃度為橫座標，以平均OD值為縱坐標，考察對BBF的抑制作用。

　　2.2　考察對BBF形成的影響

　　圖1注射用雙黃連對大腸桿菌BBF形成的影響

　　將注射用雙黃連加水溶解，配制成5mg/ml的藥液，分別進行對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌培養的操作。注射用雙黃連對大腸桿菌BBF形成的影響結果見圖1所示。

　　3　討論

　　1)通過實驗摸索，建立了可靠而穩定的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌細菌生物膜(BBF)的模型，確定了影響因素。

　　2)96孔板清洗方法的摸索：96孔板的材質是BBF模型能夠成功建立的重要因素，確定96孔板的清洗方法：先在96孔板內加注洗液，浸泡3～5分鐘后，用手握持96孔板，甩干孔內液體;再用乙醇浸泡24小時后超聲20分鐘，自然晾干，即可。

　　3)考察了注射用雙黃連對BBF形成的影響。得出注射用雙黃連對大腸桿菌及金黃色葡萄球菌BBF的形成均有明顯的抑制作用。

　　4　結語

　　本實驗建立了可靠而穩定的BBF模型，并通過此模型考察了中藥注射用雙黃連對BBF形成的影響，篩選出能夠抑制或破壞BBF形成的活性成分，為從中藥中開發治療慢性感染性疾病的新藥提供新的篩選模型，為科學、客觀評價中醫藥在治療慢性感染方面的作用提供了新的方法。

　　醫學論文發表須知：《健康之路》雜志創刊于2002年，是經中華人民共和國新聞出版總署批準的、由廣東省科學技術協會主管、中國保健協會與廣東省醫學會主辦的面向國內外公開發行的健康科普類期刊，國際標準刊號：ISSN1671—8801，國內統一刊號：CN44—1540/R，廣告經營許可證：粵440000400123?！督】抵贰肥俏覈】当＝☆I域極具影響力與權威性的健康生活類雜志，是中共廣東省委保健辦公室指定刊物，是全國各省市處級以上領導優先閱讀的具有保健前瞻性的重要刊物。2004年，《健康之路》被中國期刊協會評為“全國深受讀者喜愛的醫療科普雜志”。