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〔摘要〕 目的 觀察不同濃度的枸杞多糖(lycium barbarum polysaccharide, LBP)對體外高糖環境下培養的人視網膜血管內皮細胞(human retinal capillary endothelial cells, HRCEC)增殖及血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)表達的影響。方法 獲取人眼球摘除術后的HRCEC,予以體外培養,選取最佳狀態的3~4代細胞;CCK8法檢測在不同濃度LBP體外高糖環境下分別作用12、24、36 h后HRCEC的增殖情況;Western blot法檢測各組HRCEC的VEGF表達情況。結果 同一時間組間比較,高糖組HRCEC活性及VEGF的表達量均高于低糖組(P<0.05);不同濃度LBP實驗組HRCEC活性及VEGF表達量均明顯低于高糖組(P<0.05),80 μg/mL LBP組HRCEC活性及VEGF表達低于20 μg/mL LBP實驗組與40 μg/mL LBP實驗組(P<0.05);各實驗組在干預36 h時, HRCEC活性及VEGF表達低于干預12 h與24 h(P<0.05)。結論 LBP能抑制高糖環境下HRCEC的增殖并下調VEGF的表達,并與LBP濃度和作用時間正相關。
〔關鍵詞〕 枸杞多糖;人視網膜血管內皮細胞;血管內皮生長因子;高糖;新生血管
糖尿病視網膜病變(diabetic retinopathy, DR)發病率逐漸升高,世界范圍內的糖尿病患者中,DR患病率約34%[1],DR早期癥狀隱匿,極易導致失明[2]。DR發生的主要原因是視網膜缺血缺氧,血管內皮細胞增殖,VEGF高表達,最終視網膜新生血管(retinal neovascularization, RNV)形成,DR的主要并發癥是視網膜出血與黃斑水腫(diabetic macular edema, DME)。玻璃體腔注射抗VEGF藥物雖然是DR并發黃斑水腫的一線治療方法[3],但抗VEGF藥物(雷珠單抗、貝伐單抗、阿柏西普、康柏西普等)價格昂貴、作用時間短[4]。尋求價格低廉、安全有效的抗VEGF藥物成為目前DR研究的熱點。枸杞多糖(lycium barbarum polysaccharide, LBP)是一種天然水溶性多糖,藥理作用廣泛。LBP可以降低DM小鼠的視網膜炎癥反應、氧化應激反應及血管新生[5],LBP還可以抑制VEGF、Ang及其受體在DM小鼠視網膜中的表達,具有治療DR的作用。既往雖然較多關于LBP在糖尿病、血管內皮細胞等方面的研究,但尚未發現在人視網膜血管內皮細胞(human retinal capillary endothelial cells, HRCEC)的相關研究,本文基于LBP對小鼠糖尿病VEGF抑制作用的基礎上,研究了LBP對高糖環境下HRCEC及VEGF的影響,期望為研發防治DR新藥物提供基礎研究。
1 材料與方法
1.1 實驗材料
1.1.1 主要試劑 胎牛血清(Gibco公司,貨號04-001-1ACS);LBP(陜西康盛生物技術有限公司,KS118,純度35%);兔抗人VEGF 抗體(博奧森公司,貨號bs-0279R);β-actin(Mouse)、HRP goat anti-mouse IgG、HRP goat anti-rabbit IgG(美國proteintech公司,貨號依次為:66009-1-Ig、SA00001-1、SA00001-2);高糖培養基(SIGMA公司,貨號D5796);蛋白預染Marker(Thermo公司);SuperECL Plus超敏發光液(美國Advansta公司,貨號K-12045-D50);胰酶消化液、RIPA裂解液(中國上海碧云天生物有限公司,貨號C0201、P0013B);顯影液、定影液(中國上海佳信公司,BW-61、BW-62);蛋白裂解液(中國上海碧云天公司,貨號P0013B);TEMED(中國上海阿拉丁公司,T105497);SDS(中國大連美倫公司,貨號MB2479);第Ⅷ因子相關抗原抗體(Abcam公司)。
1.1.2 LBP溶液的配制 LBP母液配置:稱取35%含量LBP 10 mg,加入10 mL DMEM高糖培養基稀釋,搖勻、溶解,500 r/min離心5 min,雙層0.22 μm微孔濾膜過濾細菌及沉淀,并密封分裝,4 ℃保存。此時母液配置完成,含量為1 mg/mL。配置實驗LBP濃度,移取母液200 μL置于15 mL離心管中,加入DMEM高糖培養基至10 mL,反復搖勻,配置成20 ?滋g/mL LBP,做好標記,置于4 ℃冰箱保存。
1.2 實驗方法
1.2.1 HRCEC的培養 在南華大學第二附屬醫院手術室選取角膜移植手術后余下的眼球,慶大霉素注射液浸泡30 min,分離視網膜神經上皮層,常溫下2%胰蛋白酶消化,過濾,加入20%小牛血清培養液停止消化,1 200 r/min離心8 min,去除上清液,在離心管內加入10% Gibico FBS+1%雙抗的DMEM培養基吹打混勻,接種于含有10% Gibico FBS+1%雙抗的DMEM培養基,再置入37 ℃、5% CO2培養箱培養。待細胞鋪滿整個培養皿底部約80%時進行傳代。
1.2.2 HRCEC鑒定 (1)細胞爬片;(2)固定:PBST洗涕,加入4%PFA(多聚甲醛),4 ℃細胞培養箱30 min固定;(3)按照Western blot實驗步驟進行破膜封閉、一抗孵育、二抗孵育;(4)包埋:抽取已二抗孵育好的細胞爬片,PBST緩沖液清洗,滴取1滴Fluoromount-G后蓋玻片再蓋上;(5)陽性染色鏡檢示:經過山羊抗小鼠IgG二抗橙紅色DyLight594熒光標記。顯微鏡下觀察并采集圖像。
1.2.3 實驗分組 取對數生長的細胞進行分組:(1)AL組:低糖對照組(低糖+細胞);(2)AG組:高糖對照組(高糖+細胞);(3)A1組:20 μg/mL LBP實驗組;(4)A2組:40 μg/mL LBP實驗組;(5)A3組:80 μg/mL LBP實驗組。其中低糖濃度為1 g/L,高糖濃度為4.5 g/L;實驗組為不同濃度LBP+高糖培養基+細胞。
1.2.4 CCK8法行細胞增殖活性的檢測 取對數生長期的細胞,消化計數,以5×103個細胞/孔密度接種于96孔板內,每孔100 μL。各組均設5個復孔,培養貼壁,每孔加入10 μL/孔的CCK8,用完全培養基配置CCK8溶液,去除含藥培養基每孔加入100 μL含有CCK8的培養基。37 ℃,5% CO2繼續孵育4 h后于Bio-Tek酶標儀測定450 nm處吸光度(OD)值,測定各組HRCEC的增殖活性。
增殖抑制率=(高糖對照組OD值-藥物干預組OD值)/高糖對照組OD值×100%
1.2.5 Western blot 蛋白檢測 (1)PBS洗滌細胞,3 000 r/min離心2 min,加入120 μL RIPA裂解液,超聲破碎1.5 min;冰上裂解;4 ℃,12 000 r/min離心15 min;取上清液。按照BCA法,測定550nm之間波長的吸光值,根據標準曲線計算蛋白濃度。(2)樣品準備:取80 μL蛋白上清,加入20 μL 5*loading buffer混勻,沸水煮5 min,放入冰盒中速冷備用。(3)電泳:點入marker 2 μL,其它按照分組順序每孔上樣15 μL已變性蛋白。恒定電壓75 V,130 min。(4)轉膜:分別切膠VEGF(24kD),β-actin(42kD);300 mA恒定電流轉膜,VEGF約39 min,β-actin 約60 min。(5)封閉:用1*PBST配制5%脫脂奶粉,室溫封閉60 min,4 ℃過夜,次日室溫放置30 min。(6)一抗孵育:加入一抗(Rabbit Anti-VEGF antibody (bs-0279R),1∶1 000;Mouse anti-β-actin antibody(66009-1-Ig)1∶5 000,室溫孵育90 min;1*PBST洗3次,每次15min。(7)二抗孵育:加入二抗(HRPgoatanti-mouse IgG,SA00001-1,1∶5 000;HRPgoat anti-rabbit IgG,SA00001-2,1∶6 000)溫孵育90 min后1*PBST洗3次,每次10 min。(8)顯色/曝光:化學發光法(chemiluminescence, ECL)顯色曝光,顯影沖洗,Image lab軟件分析灰度值。
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