對于皮膚科中芯片的應用有哪些呢，正確認識有關芯片應用時的一些技巧對皮膚又有什么危害或影響呢， 怎樣來加強對這方面的管理呢?本文選自：《中華皮膚科雜志》,《中華皮膚科雜志》系中華醫學會主辦的中華系列雜志之一，由中國醫學科學院、中國協和醫科大學皮膚病研究所承辦。高、中、初級皮膚性病科醫師、科研、預防、醫療和教學人員為主要讀者。

　　摘要：在皮膚科學研究中,被毛突變小鼠都是用來研究人類同源基因疾病良好的動物模型。國內外研究者已獲得了20多個被毛突變系小鼠,如在皮膚、免疫及腫瘤領域得到廣泛運用的裸小鼠;表皮病變引起被毛異常的hr小鼠和ic小鼠;章金濤等的豫醫無毛小鼠;李善如等發現的被毛突變無毛小鼠等等。

　　關鍵詞：皮膚科,醫學論文,論文發表

　　QPCR芯片基本原理及相關應用

　　每張QPCR芯片如同上百個QPCR微反應池的集成,每個微反應池都固定有基因特異性引物,當加入含有模板和熒光基團的QPCR反應體系后,在相同的反應條件下,不同的基因都能同時進行特異性擴增,每個微反應池的位置信息就代表了某個特定基因,利用熒光信號的積累實時監測每個微反應池中PCR反應的過程,最后通過標準曲線就能同時對上百個基因mRNA或cDNA進行準確定量分析[3]。與基因芯片相比,QPCR芯片的通量顯著減低,一次至多檢測96個或384個基因,基本相當于基因芯片通量的1%,但是QPCR芯片的擴增對象經過仔細選擇,是某一組織或病變類型高度相關的基因,更便于數據的分析處理,檢測基因還可以隨研究需要加以改動,便于操作,而且價格比較低廉。基因芯片和QPCR芯片的原理不同,但對于基因表達譜而言,他們的檢測對象(mRNA或cDNA)到實驗結果(表達豐度),QPCR與基因表達芯片都高度一致,許多研究者都把這兩種方法作為互相印證的手段,而對于幾十個甚至幾百個基因的表達豐度檢測,QPCR技術完全可以取代基因芯片[4]。

　　基因芯片通過對來源于不同個體(正常與患者)、不同組織或不同發育階段組織細胞內的mRNA(經逆轉錄后產生的cDNA)進行檢測,可以對這些基因表達的個體特異性、組織特異性、發育階段特異性等進行綜合的分析與判斷,迅速將某個或幾個基因與病變聯系起來,也為進一步研究基因間相互作用關系提供參考。那么中等通量的QPCR技術是否能夠解決同樣的問題呢?答案是肯定的。計算機預測是將基因表達水平的數據與分子信號過程進行聯系的關鍵步驟。

　　目前廣泛運用的軟件是根據基因表達量的變化,計算機結合已知信號通路的信息,將“宏觀表型”與分子信號過程結合。由于這一軟件預測的基礎是已知信號過程,并不能預測新的未知信號過程,所以對基因芯片的海量數據的利用率有限。而在QPCR芯片的設計過程中,研究者依據已知的信號過程選擇檢測對象,盡管選擇的基因總數不多,但可能都是預測軟件的參考基因,同樣會得到較好的結果[5]。在當今生物科學和醫學領域,QPCR作為一種新型實用研究工具得到了越來越高度的重視,其使用量逐年上升,但是QPCR芯片技術的應用才剛剛處于起步階段。有關學者開始利用QPCR芯片技術進行多領域醫學研究,取得了有突破性意義的成果。SamarS.Azab,SalamaA.Salama等[6]認為雌激素天然衍生物2-甲基雌二醇作為(2-me-thoxyestradiol,2ME),在臨床試驗中是乳腺癌一個重要的評價對象。他們在兩種治療組中通過QPCR芯片技術測試鑒定了Dox細胞毒性單獨處理和協同2ME處理后細胞的基因表達差異。其研究主要目標是評估2-甲基雌二醇在對阿霉素多耐藥性乳腺癌細胞(MCF-7/Dox)產生的調節影響及其潛在的作用機理。

　　IrmaAiroldi,EmmaDiCarlo,ClaudiaCocco等認為IL-12RB2在人類B細胞惡性腫瘤中是最為腫瘤抑制基因存在作用的。大鼠IL-12基因敲出后自然產生了B細胞惡性腫瘤,而且有了肺上皮細胞腫瘤。但是IL-12沒有能力對表達IL-12受體的B16黑色素瘤細胞有直接作用。他們利用QPCR芯片對大鼠IL-12基因正常組和敲出組進行測試,發現IL-12能通過抑制血管生成來降低表達IL-12受體的B16細胞的致瘤性[7]。AndreasHald,BirgitteRono等[8]認為除了在宿主防御方面表現明顯的重要性,巨噬細胞已經被證明在不同的病態條件,包括慢性炎癥、動脈粥樣硬化和癌癥中扮演一個有害的作用。而巨噬細胞活化和遷移與細胞外基質降解密切相關。這個過程可以通過多個蛋白水解酶完成。在這項研究中,他們利用QPCR芯片進行分析,發現LPS誘導基質金屬蛋白酶的表達,同時降低基質金屬蛋白酶抑制劑的表達。此外,基因間的比較的表達水平相關的蛋白酶透露他們之間存在較大的差異基因表達水平,凸顯了巨噬細胞的基因表達調控的復雜性。除了這些文章還有學者分別對病原微生物檢測[9][10]、炎癥反應研究[11]等方面進了相關研究,得到了很好的研究成果。

　　QPCR芯片在皮膚科學中的應用前景

　　通常認為毛發多少與毛囊數量及毛囊發育周期相關,許多研究集中在毛囊本身及毛囊與皮膚微環境信號分子的相互關系上,如hid和sa等基因直接作用于毛球,引起毛發發育障礙[16],而經過皮膚病理學家JohnSundberg博士的鑒定,snthr-1Bao稀毛小鼠皮膚的主要病變是過度角化,導致毛發生長困難,毛囊的數目并未顯著減少、主要形態結構基本正常。因此,snthr-1Bao小鼠和hr等小鼠一樣,是表皮角化、毛發阻生、皮膚慢性損傷并發無菌性炎癥的理想模型。僅從組織病理學來看,snthr-1Bao稀毛突變小鼠皮膚的原發病變與人類Alagile綜合癥比較相似。

　　Alagile綜合癥為常染色體隱性遺傳性疾病,臨床表現為頭皮斑禿和全身廣泛毛發稀少,性腺功能減退,身材發育延遲等;病組織理表現為表皮輕度棘皮病樣改變,角化過度而深入毛孔形成角栓,但目前該病分子機制尚未完全清楚[17],需要開發出相應的模型進行分子水平上的研究。“皮膚表達關鍵基因QPCR芯片”可以為這方面的研究提供了一種新的嘗試。從QPCR芯片開發的角度,snthr-1Bao稀毛小鼠也是待開發的“皮膚表達關鍵基因QPCR芯片”很好的試驗對象,可以為芯片的設計、優化及將來的推廣應用提供了最直接的檢驗。再例如在皮膚科學中,瘢痕疙瘩是在皮膚創傷愈合過程中成纖維細胞過度增殖和膠原過度分泌所致的病理性瘢痕,目前尚無確切有效的藥物。眾多學者通過大量基礎實驗研究和臨床證據表明,瘢痕疙瘩的發生機理與多個基因的功能活動密切相關。

　　SmithJC,BooneBE,OpalenikSR[18]等通過使用QPCR研究發現降低Wnt信號表達的多種抑制因素對瘢痕疙瘩成纖維細胞表面這個基因的作用。同時發現在正常細胞中的誘餌受體IL-13Rα2是低表達,在瘢痕疙瘩中幾乎不存在。得到QRT-PCR證實的有用結論是,支持在瘢痕疙瘩治療中提高IL-13的活性。Chang等.(2002)[19]通過研究發現HOX基因在發育的胚胎階段有重要作用,能夠調節人的分化細胞,包括人類的真皮纖維母細胞,不同的HOX基因表達可能成為組成瘢痕疙瘩的惡性表型。魏斌,范金財等[20]運用RNAi干擾正常皮膚成纖維細胞前列腺素內過氧化物合酶2(PTGS2)基因的表達,利用realtimeRT-PCR驗證siRNA沉默效果;應用全基因組芯片檢測基因表達譜變化。

　　檢測到與PTGS2基因相關的、在瘢痕疙瘩形成中可能共同發揮作用的相關基因,證明PTGS2與瘢痕疙瘩的發病機制有著密切的關系,為治療瘢痕疙瘩提供了一個潛在的候選靶點。BockO,YuH,ZitronS[21]研究了beta1-3和它們的受體IandII對皮膚纖維原細胞的影響。其他的一些基因,包括IGFBP-2,IGFBP-5,FZD7,HOXD,STAT1,IGFBP-3和HOXA,都位于染色體臂2q或者7p,都認為與瘢痕疙瘩形成有一定的關聯(Marner-os,2004)[22]。因此研發相關的QPCR芯片,運用這種先進的技術手段,來探討這些基因對于對于瘢痕疙瘩發生的作用機制;觀察敲減或者改變這些基因的表達,是否導致正常皮膚成纖維細胞全基因表達譜向瘢痕疙瘩方向改變,以期在基因水平上探索無瘢痕創傷愈合的新途徑。