【摘要】 血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2(ACE2)可能通過腎素血管緊張素醛固酮系統(tǒng)(RAAS)或通過對一些新型調(diào)節(jié)肽系統(tǒng)的調(diào)制作用來調(diào)節(jié)心血管的功能, 但是否參與AMI后機(jī)體對心肌缺血缺氧的調(diào)節(jié)反應(yīng)還不清楚. 我們從基因轉(zhuǎn)錄水平(mRNA)觀察SD大鼠AMI后梗死區(qū)及非梗死區(qū)的左心室肌細(xì)胞ACE2 mRNA表達(dá)量的變化.

　　【關(guān)鍵詞】 大鼠,ACE2 mRNA,心肌梗死

　　0引言

　　1材料和方法

　　1.1材料總RNA抽提試劑盒(Trizol試劑盒)由Invitrogen公司提供, RTPCR試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司. ACE2引物及內(nèi)參基因引物, 以及PCR產(chǎn)物測序由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成. 低溫離心機(jī)(賀利氏228RS，德國). 紫外光分光光度儀(導(dǎo)津22201，日本), PCR 儀(Biometra，德國)，電泳儀(京華，中國北京). 全自動凝膠成像分析系統(tǒng)(法碼西亞，美國). SD大鼠(武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供)36只。

　　成年雌性，質(zhì)量200~250 g，隨機(jī)分為1 d組(n=12), 3 d組(n=12), 28 d組(n=12). 每組再隨機(jī)分為對照組(假手術(shù)組)、手術(shù)組(心梗組)2個亞組. 大鼠用200 g/L烏拉坦(200 mg/kg) ip麻醉，同時行氣管插管，接小動物呼吸機(jī)給予通氣. 然后左側(cè)開胸術(shù)，打開心包，用5~0絲線在左心耳下1～2 mm處結(jié)扎左前降支近端. 其成功標(biāo)志為：心電圖ST段弓背向上抬高或出現(xiàn)病理性Q波，直視下可見被結(jié)扎血管供應(yīng)區(qū)心肌變?yōu)樯n白色或發(fā)生區(qū)域性運(yùn)動障礙. 對照組重復(fù)上述步驟，不結(jié)扎冠狀動脈. 結(jié)扎中存活的大鼠和對照組大鼠接受相同的飼養(yǎng)條件，包括任意食物，水和每12 h晝/夜循環(huán). 術(shù)后給予青霉素100 000 U im預(yù)防感染.

　　1.2方法烏拉坦麻醉下打開胸腔, 迅速取出心臟，置于4.0℃預(yù)冷的生理鹽水漂洗除去過量的血液. 小心切去右心室和右心耳，僅保存左室非梗死區(qū)域及梗死區(qū)域. 剪碎后，放入液氮中保存. 取左室梗死區(qū)和非梗死區(qū)心肌組織各100 mg，用Trizol試劑抽提心肌組織總RNA，各RNA樣本A260 nm/A280 nm的比值均為1.8～2.0. 根據(jù)Genebank的序列，并參考相關(guān)文獻(xiàn)[1]，分別設(shè)計(jì)ACE2，GAPDH，并由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成. 用RTPCR試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增反應(yīng). PCR反應(yīng)體系：cDNA 4 μL, Takara Taq 0.5 U，MgCl2 30 μmol/L，8 pmol上下游引物，10×PCR Buffer，加入去離子水至總體積20 μL.

　　GAPDH基因反應(yīng)條件：94.0℃ 5 min，首次循環(huán)94.0℃ 30 s，55℃ 30 s，72.0℃ 45 s，共32個循環(huán)，結(jié)束前72.0℃ 10 min，4.0℃ 5 min. ACE2基因反應(yīng)條件：94.0℃ 5 min，首次循環(huán)94.0℃ 30 s，57℃ 30 s，72.0℃ 45 s，共32個循環(huán)，結(jié)束前72.0℃ 10 min，4.0℃ 5 min. PCR產(chǎn)物經(jīng)20 g/L的瓊脂糖凝膠電泳，用全自動凝膠成像分析系統(tǒng)對凝膠成像，用ImageTool2.0分析各電泳條帶灰度積分，以磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)的灰度積分作為標(biāo)準(zhǔn)校正. ACE2 PCR產(chǎn)物的相對量=ACE2電泳條帶灰度積分/GAPDH電泳條帶灰度積分，進(jìn)行半定量分析. 對PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，由上海生物工程有限公司測序部完成.

　　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：所有數(shù)據(jù)以x±s表示, 應(yīng)用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件，組間均數(shù)比較用方差分析，P<0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

　　2結(jié)果

　　應(yīng)用PCR上下游引物對其產(chǎn)物進(jìn)行正向和反向測序，把目標(biāo)基因擴(kuò)增片段測序結(jié)果與Gene Bank目標(biāo)基因全序列應(yīng)用Blast引擎進(jìn)行比較，目標(biāo)基因ACE2被擴(kuò)增片段的序列與其所在基因上的相應(yīng)序列一致(圖1). 在d 1，與假手術(shù)組相比，手術(shù)組梗死區(qū)及非梗死區(qū)ACE2 mRNA水平均無差異(P>0.05，表1). 在d 3，與假手術(shù)組相比，手術(shù)組梗死區(qū)ACE2 mRNA水平明顯升高(P<0.01)，手術(shù)組非梗死區(qū)ACE2 mRNA水平無改變;與手術(shù)組非梗死區(qū)相比，手術(shù)組梗死區(qū)ACE2 mRNA水平明顯升高(P<0.01). d 28，與假手術(shù)組相比，手術(shù)組梗死區(qū)及非梗死區(qū)ACE2基因mRNA均水平明顯升高(P<0.01);與手術(shù)組非梗死區(qū)相比，手術(shù)組梗死區(qū)ACE2 mRNA水平無差異.

　　A: 1 d; B: 3 d; C: 28 d.1: 假手術(shù); 2: 非梗死區(qū); 3: 梗死區(qū); M: Marker.

　　圖1大鼠AMI后ACE2 mRNA表達(dá)水平(略)

　　表1大鼠AMI后ACE2 mRNA水平變化(略)

　　bP<0.01 vs假手術(shù)和急性心梗非梗死區(qū); cP<0.01 vs假手術(shù).

　　3討論

　　近年來有研究表明，ACE2在人和嚙齒類動物的心臟中高度表達(dá)，而且ACE2的作用與ACE相拮抗，ACE將AngⅠ轉(zhuǎn)化為強(qiáng)的縮血管物質(zhì)AngⅡ，ACE2則將AngⅡ轉(zhuǎn)化為強(qiáng)舒血管物質(zhì)Ang17，從而平衡腎素血管緊張素系統(tǒng)，達(dá)到調(diào)節(jié)心臟功能的作用[2].

　　又有報(bào)道表明RAAS的組成成分ACE, AngⅡ等在AMI后被激活[3]，但AMI后有關(guān)ACE2的研究尚未見報(bào)道. 本研究發(fā)現(xiàn)在大鼠AMI的早期(d 3)，梗死區(qū)ACE2 mRNA的表達(dá)即增加，并持續(xù)到第28日，到第28日非梗死區(qū)ACE2 mRNA的表達(dá)也增加. AMI后ACE2的增加可能對心肌缺血后激活的腎素血管緊張素系統(tǒng)進(jìn)行負(fù)性平衡調(diào)節(jié)起到重要作用，主要是通過增加舒血管物質(zhì)Ang17的水平來限制心肌AngⅡ水平增加產(chǎn)生的負(fù)效應(yīng)，從而有利于心臟功能的保護(hù)Crackower等[4]

　　研究發(fā)現(xiàn)小鼠在ACE2基因敲除后表現(xiàn)出心室腔擴(kuò)大和心肌收縮能力減退，AngⅡ水平增加，而且缺氧誘導(dǎo)基因的表達(dá)增多，進(jìn)一步將ACE和ACE2雙基因敲除后，發(fā)現(xiàn)與ACE2敲除小鼠相比，雙基因敲除小鼠心功能完全正常. 充分說明了ACE2能夠調(diào)節(jié)心臟的收縮性，降低心臟的AngⅡ水平，及減少缺氧誘導(dǎo)基因的表達(dá). 目前有研究發(fā)現(xiàn)：G蛋白藕聯(lián)受體(Mas)是Ang17的高親和力功能性受體，Ang17是一種血管舒張因子，通過與特異性受體Mas結(jié)合，通過激肽、NO，前列腺素等途徑拮抗AngⅡ所產(chǎn)生的病理生理效應(yīng)[5-6].

　　因此推斷ACE2對AMI及其后的心衰的保護(hù)效應(yīng)可能是通過調(diào)節(jié)心臟的收縮性，降低心臟的AngⅡ水平，生成一定量的Ang17及減少缺氧誘導(dǎo)基因的表達(dá)等一系列效應(yīng)來發(fā)揮的. 本試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)ACE2也參與了AMI后期非梗死區(qū)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用，其保護(hù)途徑可能與上面類似. 總之，本研究表明通過提高ACE2水平可能為心梗及隨后的心衰的治療提供一種可能性. 對ACE2 和Ang17作用的干預(yù)將可能是今后治療心血管和其他相關(guān)疾病的一個很有前途的發(fā)展方向.