【摘要】 FFPET的提取方法多種多樣，如水煮法、酚氯仿抽提法、單純消化法、Chelex100提取法等[36]，均旨在更加高效、高質(zhì)量地提取DNA。石蠟包埋組織DNA提取的數(shù)量及質(zhì)量與組織的量、消化時間、純化方法等有關(guān)[7]。本實驗對脫蠟、消化做了一些優(yōu)化。

　　【關(guān)鍵詞】 石蠟組織,DNA提取,Chelex,100提取法

　　醫(yī)院病理科存在大量各種疾病甲醛固定石蠟包埋組織(formalin fixed and paraffin embedded tissues， FFPET)，為分子病理研究提供了大量的信息來源。然而福爾馬林固定后的蠟塊包埋組織DNA降解嚴(yán)重[1]，檔存FFPET組織切取量有限，傳統(tǒng)酚氯仿提取DNA步驟繁雜，提取過程損失嚴(yán)重等都制約了石蠟組織在分子病理學(xué)中的研究應(yīng)用[2]。如何高效、高質(zhì)量提取微量石蠟組織DNA對利用石蠟組織進(jìn)行分子研究至關(guān)重要。本實驗在前人及前期研究的基礎(chǔ)上[3]，進(jìn)一步探討改善石蠟包埋組織DNA的提取方法及各種方法在不同條件下的應(yīng)用。

　　1 材料與方法

　　1.1 材料

　　選用海南醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科2006～2007年間存檔的胃癌、乳腺癌、鼻咽癌、結(jié)腸癌石蠟包埋組織各25例。所用物品包括PCR儀(Biometra)、蛋白酶K(Merck公司)、Taq DNA聚合酶(北京華美)、Chelex100(BioRad I～boratory)。

　　1.2 方法

　　黃幼生等.四種微量石蠟組織DNA提取方法的比較

　　1.2.1 提取DNA方法 將每例石蠟包埋組織塊切片6μm厚，分裝于4個EP管中，每管5片(鼻咽癌組織10片)，切不同病例的蠟塊時用二甲苯擦洗刀片2遍，以免交叉污染。先統(tǒng)一去蠟：在每管中加入二甲苯1mL置于55℃恒溫?fù)u床中，20min后12000r/min離心10min，去上清，加入新鮮二甲苯重復(fù)一次;再用無水乙醇洗滌2次以脫去二甲苯，離心后棄上清，在55℃恒溫箱干燥沉淀。采用4種方法提取DNA：(1)單純消化法：用100μL的組織裂解液(0.2%SDS，10mmoL/L TrispH8.0，0.5mmoL/LEDTApH 8.0)懸浮沉淀，加入5μL蛋白酶K(20mg/mL)消化，55℃振搖8h或過夜至溶液澄清。98℃加熱10min滅活蛋白酶K，冰上3min，12000r/min 離心取上清(DNA在上清液中)，4℃儲存?zhèn)溆谩?2)Chelex100提取法：步驟同單純消化法，提取上清后，在上清液中加入5%Chelex100顆粒，4℃過夜儲存?zhèn)溆谩?3) 酚氯仿抽提法：在EP管中加入200 mL蛋白酶K緩沖液(50 mmol/L TrisHCl pH 8.0，5 mmol/LEDTA pH 8.0，0.2%Tween20)及5 μL 蛋白酶K(20mg/mL)，置55℃水浴振搖過夜，取出后煮沸10min，離心，取上清;用等量酚—氯仿—異戊醇抽提2次;加2.5倍冰無水乙醇(-20℃)和1/10體積3mol/L乙酸鈉沉淀DNA，-20℃靜置3h;取出后4℃下14000 r/min 離心15min，棄上清。用70%乙醇洗滌沉淀2次，室溫通風(fēng)干燥沉淀后用50μL TE液(pH8.0)溶解DNA，4℃保存。(4)水煮法：在EP 管中加入100μL 去離子水。室溫靜置2h后98℃加熱15min，12000r/min離心10min后取上清即為模板DNA。

　　1.2.2 PCR擴(kuò)增 選擇3對多態(tài)性位點引物，由上海生物工程公司(Sangong)合成。引物序列、退火溫度及擴(kuò)增片段長度見表1。PCR反應(yīng)體系為25μL，10×PCR反應(yīng)緩沖液2.5μL;25mmoL/L MgCl21.5μL;10mmoL/L dNTP0.5μL;10vmoL/L引物各1μL;模板2μL;5U/μL Taq聚合酶0.5μL，余下由滅菌去離子水補足。經(jīng)94℃變性5min后進(jìn)入循環(huán)：94℃變性30min;退火45s;72℃延伸30s，完成35個循環(huán)后.于72℃下延伸5min。每次PCR反應(yīng)均設(shè)陽性、陰性對照。

　　表1 PCR擴(kuò)增所用引物列表

　　引物名稱序列長度(bp)退火溫度(℃)

　　D1S3466ATGTCTTTGATCCTATGGAAGG18920956

　　TGGGTAACAGACCCTGTCTC

　　SS903GTCAGGGCGTCTTCCCAGTT28560

　　TGAGCCTCGGCATCTACATCTT

　　SS448AGGCGTGTCCTTTCGTTTCT46861

　　GCCACTCCCACTGCTCAA

　　1.2.3 DNA鑒定方法 (1)DNA質(zhì)量的瓊脂糖凝膠電泳鑒定:取5μL DNA加1μL的DNA loading buffer混勻上樣，在2%的瓊脂糖凝膠中80V電泳30min，在紫外凝膠成像儀下觀察所提取DNA基因組及PCR產(chǎn)物的質(zhì)量并拍照存檔。(2)DNA純度量鑒定;各取5μLDNA樣品，加水至500μL混勻后，轉(zhuǎn)入分光光度計的石英比色杯中，先用500μL水校正零點，于260nm和280nm處分別讀出吸光度(OD)值，檢測DNA的OD值。

　　2 結(jié)果

　　海南醫(yī)學(xué)院學(xué)報 Vol.16 No.9 Sep.2010

　　4種方法提取的DNA經(jīng)凝膠電泳分析顯示，Chelex100提取法、單純消化法提取的DNA100%有條帶出現(xiàn)，主要集中在400～1000bp;水煮法提取的DNA46.3%有條帶出現(xiàn)，主要集中在100bp以下;傳統(tǒng)酚氯仿提取的DNA15%有條帶出現(xiàn)，主要集中在500～1500bp之間。4種方法提取的DNA經(jīng)分光光度計測定顯示Chelex100提取法、酚氯仿抽提法提取的DNA純度無明顯差異(P>0.05)，但優(yōu)于另外2種方法(P<0.05)。4種方法提取的DNA量及純度見表2。

　　表2 4種方法提取的DNA平均純度及產(chǎn)量(n=100)(±s)

　　提取方法純度(260/280)DNA產(chǎn)量(μg/100mg)

　　Chelex100提取法1.73±0.3352.9±8.76

　　單純消化法 1.18±0.31 55.4±10.41

　　水煮法 1.03±0.23 3.1±0.25

　　酚氯仿抽提法 1.78±0.29 1.2±0.57

　　4種方法提取的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，小于200bp長度片段擴(kuò)增，Chelex100提取法、單純消化法陽性率分別為88.8%、78.8%，明顯優(yōu)于酚氯仿抽提法(15.0%)及水煮法(21.3%)(P均<0.01)。隨著擴(kuò)增長度的增加，PCR擴(kuò)增效率逐漸降低，285bpDNA片段4種方法PCR擴(kuò)增效率分別為86.8%(Chelex100提取法)、67.5%(單純消化法)、13.8%(水煮法)、12.5%(酚氯仿抽提法)(圖1);485bp擴(kuò)增效率分別為71.3%、52.5%、5%、12.5%。總的PCR反應(yīng)陽性率分別為82.5%、66.5%、13.4%、13.4%。1年后4種方法提取的DNA重復(fù)PCR擴(kuò)增，小于200bp片段PCR擴(kuò)增陽性率無明顯變化，但大于200bp片段擴(kuò)增效率明顯降低，總陽性率分別為80.1%、31.7%、2.5%、9.2%。

　　注：1：Marker(100bp/band);24：Chelex100法;57：單純消化法;810：酚氯仿法;1113：水煮法;14：陽性對照;15：陰性對照

　　圖1 不同方法提取的DNA PCR反應(yīng)電泳圖(引物SS903)

　　3 討論

　　新鮮組織的收集及長期保存困難，各醫(yī)院存在大量各種疾病的石蠟包埋組織，石蠟包埋組織DNA的提取解決了DNA研究依賴于新鮮或冰凍組織和細(xì)胞的這一難題[3]。

　　在剔除多余的蠟塊后，把二甲苯脫蠟的時間、次數(shù)縮短，由傳統(tǒng)的 3 h以上縮短到 1 h左右，同時減少操作步驟，這樣就減少操作過程中DNA的丟失、斷裂，達(dá)到減少原始蠟塊組織成本的目的。消化過程中，消化時間過長可以充分消化組織，提高DNA的含量及純度，然而時間的延長，又使得DNA斷裂增加，且不利于連續(xù)操作，本實驗選取消化時間主要以組織消化徹底，組織消化液變清亮為標(biāo)準(zhǔn)，微量石蠟組織在10～12h左右即可消化充分，無須消化3～4d。常規(guī)的純化方法是酚氯仿反復(fù)抽提，隨后高鹽沉淀DNA、乙醇洗滌、干燥后溶解保存。這種方法步驟繁雜，DNA損失嚴(yán)重，微量石蠟組織通?？床坏匠恋?，而至提取失敗。通過實驗觀察發(fā)現(xiàn)，石蠟組織中的蛋白質(zhì)，均已變性，充分消化后對PCR反應(yīng)造成的影響有限，對PCR反應(yīng)影響較大的是其中的金屬離子。Chelex100是一種金屬離子螯合劑，能與鎂、鈣等核酸反應(yīng)必需的二價金屬陽離子螯合，從而保護(hù)DNA，并減少由降解的DNA片段形成的雜帶，從而提高PCR反應(yīng)陽性率及重復(fù)率[3]。

　　酚氯仿抽提法是最為經(jīng)典的提取方法，主要包括二甲苯脫蠟、蛋白酶K消化、苯酚/氯仿純化、鹽析4個步驟。由于操作過程過多，頻繁移管，導(dǎo)致DNA損失、污染以及DNA斷裂的可能。本實驗結(jié)果顯示該方法所提取的DNA質(zhì)量較高，易于保存(1年后，PCR重復(fù)率為100%)。但需組織量多，提取效率低下，綜合提取率僅為5%，其中鼻咽癌由于活檢組織太小，提取率為零。因而該方法僅適用于需長期保存的大標(biāo)本DNA提取。水煮法提取的DNA數(shù)量少，片段小，不易保存，重復(fù)率低，不適合長片段DNA分析，但操作簡便，所需時間短，可應(yīng)用于快速的短片段DNA鑒定。簡單消化法與Chelex100法操作過程較簡便，改良后只需12h左右即可完成。簡單消化法提取的DNA含量與Chelex100法無明顯差異，但純度較低，PCR陽性率低于后者，兩者相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。單純消化法1年后的重復(fù)率下降較大，不易于保存;Chelex100法提取的DNA純度較單純消化法高，與其他方法相比，PCR陽性率及1年后重復(fù)率最高，與其他方法相比，差異有顯著性(P<0.01)。因而Chelex100法最適用于一般的FFPET的DNA提取，且易于保存。

　　總之，甲醛固定石蠟包埋組織是一種信息含量大且經(jīng)濟(jì)的寶貴資源，但其中的核酸降解嚴(yán)重，如何高效高質(zhì)提取其中的DNA來滿足進(jìn)一步實驗研究要求值得探討。Chelex100提取法方便簡單，適用于微量石蠟組織DNA擴(kuò)增分析;單純消化法及水煮法在一定條件下適用于微量石蠟組織短片段DNA的擴(kuò)增。