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【摘要】 FFPET的提取方法多種多樣,如水煮法、酚氯仿抽提法、單純消化法、Chelex100提取法等[36],均旨在更加高效、高質量地提取DNA。石蠟包埋組織DNA提取的數量及質量與組織的量、消化時間、純化方法等有關[7]。本實驗對脫蠟、消化做了一些優化。
【關鍵詞】 石蠟組織,DNA提取,Chelex,100提取法
醫院病理科存在大量各種疾病甲醛固定石蠟包埋組織(formalin fixed and paraffin embedded tissues, FFPET),為分子病理研究提供了大量的信息來源。然而福爾馬林固定后的蠟塊包埋組織DNA降解嚴重[1],檔存FFPET組織切取量有限,傳統酚氯仿提取DNA步驟繁雜,提取過程損失嚴重等都制約了石蠟組織在分子病理學中的研究應用[2]。如何高效、高質量提取微量石蠟組織DNA對利用石蠟組織進行分子研究至關重要。本實驗在前人及前期研究的基礎上[3],進一步探討改善石蠟包埋組織DNA的提取方法及各種方法在不同條件下的應用。
1 材料與方法
1.1 材料
選用海南醫學院附屬醫院病理科2006~2007年間存檔的胃癌、乳腺癌、鼻咽癌、結腸癌石蠟包埋組織各25例。所用物品包括PCR儀(Biometra)、蛋白酶K(Merck公司)、Taq DNA聚合酶(北京華美)、Chelex100(BioRad I~boratory)。
1.2 方法
黃幼生等.四種微量石蠟組織DNA提取方法的比較
1.2.1 提取DNA方法 將每例石蠟包埋組織塊切片6μm厚,分裝于4個EP管中,每管5片(鼻咽癌組織10片),切不同病例的蠟塊時用二甲苯擦洗刀片2遍,以免交叉污染。先統一去蠟:在每管中加入二甲苯1mL置于55℃恒溫搖床中,20min后12000r/min離心10min,去上清,加入新鮮二甲苯重復一次;再用無水乙醇洗滌2次以脫去二甲苯,離心后棄上清,在55℃恒溫箱干燥沉淀。采用4種方法提取DNA:(1)單純消化法:用100μL的組織裂解液(0.2%SDS,10mmoL/L TrispH8.0,0.5mmoL/LEDTApH 8.0)懸浮沉淀,加入5μL蛋白酶K(20mg/mL)消化,55℃振搖8h或過夜至溶液澄清。98℃加熱10min滅活蛋白酶K,冰上3min,12000r/min 離心取上清(DNA在上清液中),4℃儲存備用。(2)Chelex100提取法:步驟同單純消化法,提取上清后,在上清液中加入5%Chelex100顆粒,4℃過夜儲存備用。(3) 酚氯仿抽提法:在EP管中加入200 mL蛋白酶K緩沖液(50 mmol/L TrisHCl pH 8.0,5 mmol/LEDTA pH 8.0,0.2%Tween20)及5 μL 蛋白酶K(20mg/mL),置55℃水浴振搖過夜,取出后煮沸10min,離心,取上清;用等量酚—氯仿—異戊醇抽提2次;加2.5倍冰無水乙醇(-20℃)和1/10體積3mol/L乙酸鈉沉淀DNA,-20℃靜置3h;取出后4℃下14000 r/min 離心15min,棄上清。用70%乙醇洗滌沉淀2次,室溫通風干燥沉淀后用50μL TE液(pH8.0)溶解DNA,4℃保存。(4)水煮法:在EP 管中加入100μL 去離子水。室溫靜置2h后98℃加熱15min,12000r/min離心10min后取上清即為模板DNA。
1.2.2 PCR擴增 選擇3對多態性位點引物,由上海生物工程公司(Sangong)合成。引物序列、退火溫度及擴增片段長度見表1。PCR反應體系為25μL,10×PCR反應緩沖液2.5μL;25mmoL/L MgCl21.5μL;10mmoL/L dNTP0.5μL;10vmoL/L引物各1μL;模板2μL;5U/μL Taq聚合酶0.5μL,余下由滅菌去離子水補足。經94℃變性5min后進入循環:94℃變性30min;退火45s;72℃延伸30s,完成35個循環后.于72℃下延伸5min。每次PCR反應均設陽性、陰性對照。
表1 PCR擴增所用引物列表
引物名稱序列長度(bp)退火溫度(℃)
D1S3466ATGTCTTTGATCCTATGGAAGG18920956
TGGGTAACAGACCCTGTCTC
SS903GTCAGGGCGTCTTCCCAGTT28560
TGAGCCTCGGCATCTACATCTT
SS448AGGCGTGTCCTTTCGTTTCT46861
GCCACTCCCACTGCTCAA
1.2.3 DNA鑒定方法 (1)DNA質量的瓊脂糖凝膠電泳鑒定:取5μL DNA加1μL的DNA loading buffer混勻上樣,在2%的瓊脂糖凝膠中80V電泳30min,在紫外凝膠成像儀下觀察所提取DNA基因組及PCR產物的質量并拍照存檔。(2)DNA純度量鑒定;各取5μLDNA樣品,加水至500μL混勻后,轉入分光光度計的石英比色杯中,先用500μL水校正零點,于260nm和280nm處分別讀出吸光度(OD)值,檢測DNA的OD值。
2 結果
海南醫學院學報 Vol.16 No.9 Sep.2010
4種方法提取的DNA經凝膠電泳分析顯示,Chelex100提取法、單純消化法提取的DNA100%有條帶出現,主要集中在400~1000bp;水煮法提取的DNA46.3%有條帶出現,主要集中在100bp以下;傳統酚氯仿提取的DNA15%有條帶出現,主要集中在500~1500bp之間。4種方法提取的DNA經分光光度計測定顯示Chelex100提取法、酚氯仿抽提法提取的DNA純度無明顯差異(P>0.05),但優于另外2種方法(P<0.05)。4種方法提取的DNA量及純度見表2。
表2 4種方法提取的DNA平均純度及產量(n=100)(±s)
提取方法純度(260/280)DNA產量(μg/100mg)
Chelex100提取法1.73±0.3352.9±8.76
單純消化法 1.18±0.31 55.4±10.41
水煮法 1.03±0.23 3.1±0.25
酚氯仿抽提法 1.78±0.29 1.2±0.57
4種方法提取的DNA進行PCR擴增,小于200bp長度片段擴增,Chelex100提取法、單純消化法陽性率分別為88.8%、78.8%,明顯優于酚氯仿抽提法(15.0%)及水煮法(21.3%)(P均<0.01)。隨著擴增長度的增加,PCR擴增效率逐漸降低,285bpDNA片段4種方法PCR擴增效率分別為86.8%(Chelex100提取法)、67.5%(單純消化法)、13.8%(水煮法)、12.5%(酚氯仿抽提法)(圖1);485bp擴增效率分別為71.3%、52.5%、5%、12.5%。總的PCR反應陽性率分別為82.5%、66.5%、13.4%、13.4%。1年后4種方法提取的DNA重復PCR擴增,小于200bp片段PCR擴增陽性率無明顯變化,但大于200bp片段擴增效率明顯降低,總陽性率分別為80.1%、31.7%、2.5%、9.2%。
注:1:Marker(100bp/band);24:Chelex100法;57:單純消化法;810:酚氯仿法;1113:水煮法;14:陽性對照;15:陰性對照
圖1 不同方法提取的DNA PCR反應電泳圖(引物SS903)
3 討論
新鮮組織的收集及長期保存困難,各醫院存在大量各種疾病的石蠟包埋組織,石蠟包埋組織DNA的提取解決了DNA研究依賴于新鮮或冰凍組織和細胞的這一難題[3]。
在剔除多余的蠟塊后,把二甲苯脫蠟的時間、次數縮短,由傳統的 3 h以上縮短到 1 h左右,同時減少操作步驟,這樣就減少操作過程中DNA的丟失、斷裂,達到減少原始蠟塊組織成本的目的。消化過程中,消化時間過長可以充分消化組織,提高DNA的含量及純度,然而時間的延長,又使得DNA斷裂增加,且不利于連續操作,本實驗選取消化時間主要以組織消化徹底,組織消化液變清亮為標準,微量石蠟組織在10~12h左右即可消化充分,無須消化3~4d。常規的純化方法是酚氯仿反復抽提,隨后高鹽沉淀DNA、乙醇洗滌、干燥后溶解保存。這種方法步驟繁雜,DNA損失嚴重,微量石蠟組織通常看不到沉淀,而至提取失敗。通過實驗觀察發現,石蠟組織中的蛋白質,均已變性,充分消化后對PCR反應造成的影響有限,對PCR反應影響較大的是其中的金屬離子。Chelex100是一種金屬離子螯合劑,能與鎂、鈣等核酸反應必需的二價金屬陽離子螯合,從而保護DNA,并減少由降解的DNA片段形成的雜帶,從而提高PCR反應陽性率及重復率[3]。
酚氯仿抽提法是最為經典的提取方法,主要包括二甲苯脫蠟、蛋白酶K消化、苯酚/氯仿純化、鹽析4個步驟。由于操作過程過多,頻繁移管,導致DNA損失、污染以及DNA斷裂的可能。本實驗結果顯示該方法所提取的DNA質量較高,易于保存(1年后,PCR重復率為100%)。但需組織量多,提取效率低下,綜合提取率僅為5%,其中鼻咽癌由于活檢組織太小,提取率為零。因而該方法僅適用于需長期保存的大標本DNA提取。水煮法提取的DNA數量少,片段小,不易保存,重復率低,不適合長片段DNA分析,但操作簡便,所需時間短,可應用于快速的短片段DNA鑒定。簡單消化法與Chelex100法操作過程較簡便,改良后只需12h左右即可完成。簡單消化法提取的DNA含量與Chelex100法無明顯差異,但純度較低,PCR陽性率低于后者,兩者相比差異有統計學意義(P<0.05)。單純消化法1年后的重復率下降較大,不易于保存;Chelex100法提取的DNA純度較單純消化法高,與其他方法相比,PCR陽性率及1年后重復率最高,與其他方法相比,差異有顯著性(P<0.01)。因而Chelex100法最適用于一般的FFPET的DNA提取,且易于保存。
總之,甲醛固定石蠟包埋組織是一種信息含量大且經濟的寶貴資源,但其中的核酸降解嚴重,如何高效高質提取其中的DNA來滿足進一步實驗研究要求值得探討。Chelex100提取法方便簡單,適用于微量石蠟組織DNA擴增分析;單純消化法及水煮法在一定條件下適用于微量石蠟組織短片段DNA的擴增。