【摘要】 由于HBV宿主范圍窄、動(dòng)物模型缺乏，體外組織培養(yǎng)也一直沒(méi)有太大進(jìn)展，且不能在體外人工培養(yǎng)，制約了對(duì)HBV的研究[1]. 將HBV DNA轉(zhuǎn)移至靶細(xì)胞，建立表達(dá)HBV的體外培養(yǎng)細(xì)胞模型對(duì)研究HBV生物學(xué)特性和肝炎發(fā)病機(jī)制有重要意義

　　【關(guān)鍵詞】 肝炎病毒，乙型;基因組，病毒;克隆，分子;轉(zhuǎn)染;細(xì)胞培養(yǎng);基因表達(dá)

　　目的： 建立HBV體外細(xì)胞培養(yǎng)體系. 方法： 構(gòu)建HBV全基因克隆質(zhì)粒pcDNA33HBV，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，G418篩選. ELISA檢測(cè)細(xì)胞上清液HBsAg，HBeAg的表達(dá)，免疫組化檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)HBcAg的表達(dá)，RTPCR檢測(cè)細(xì)胞S基因mRNA的表達(dá)，PCR檢測(cè)細(xì)胞上清液DNA. 結(jié)果： 成功構(gòu)建了HBV全基因克隆質(zhì)粒pcDNA33HBV，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HepG2后，培養(yǎng)上清HBsAg，HBeAg陽(yáng)性，細(xì)胞內(nèi)HBcAg呈核漿型分布，且以漿型分布為主. RTPCR證實(shí)有HBV S基因 mRNA 的表達(dá)，上清中HBV S及前S基因陽(yáng)性，熒光定量PCR檢測(cè)顯示培養(yǎng)上清中HBV 滴度達(dá)1×108拷貝/L. 結(jié)論： 重組質(zhì)粒pcDNA33HBV能在HepG2細(xì)胞中表達(dá)、轉(zhuǎn)錄、復(fù)制，該細(xì)胞培養(yǎng)體系能產(chǎn)生較高水平的HBV.

　　0引言

　　由于HBV宿主范圍窄、動(dòng)物模型缺乏，體外組織培養(yǎng)也一直沒(méi)有太大進(jìn)展，且不能在體外人工培養(yǎng)，制約了對(duì)HBV的研究[1]. 將HBV DNA轉(zhuǎn)移至靶細(xì)胞，建立表達(dá)HBV的體外培養(yǎng)細(xì)胞模型對(duì)研究HBV生物學(xué)特性和肝炎發(fā)病機(jī)制有重要意義[2-4]. HBV基因組呈雙鏈閉合環(huán)狀，基因結(jié)構(gòu)緊湊，其開(kāi)放讀框分布于全長(zhǎng)DNA，為使完整的轉(zhuǎn)染基因能在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，目的基因的長(zhǎng)度要大于一個(gè)HBV DNA單元[5-6]. 我們構(gòu)建3倍HBV基因的重組真核表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染細(xì)胞，以篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)病毒蛋白的細(xì)胞模型，并研究其產(chǎn)生HBV的水平.

　　1材料和方法

　　1.1材料HBV全基因亞克隆載體pUC193HBV為pUC19在EcoRⅠ及HindⅢ位點(diǎn)中插入頭尾相連的HBV(adr亞型)三連體，由山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)研究所張秋博士惠贈(zèng)，保存在大腸桿菌DH5α中. 真核細(xì)胞表達(dá)載體pcDNA3由第四軍醫(yī)大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室趙晶博士惠贈(zèng);人肝母細(xì)胞瘤細(xì)胞系(HepG2)由第四軍醫(yī)大學(xué)微生物學(xué)教研室惠贈(zèng)，本室傳代培養(yǎng);內(nèi)切酶EcoRⅠ, HindⅢ, T4 DNA連接酶,Taq DNA聚合酶,反轉(zhuǎn)錄酶及DNA marker(TakaRa公司);質(zhì)粒提取試劑盒(西安市萊博科技發(fā)展有限公司);LipofectamineTM 2000(Invitrogen公司);DMEM培養(yǎng)基，G418(Gibco公司);新生小牛血清(杭州四季青生物制品有限公司);ELISA檢測(cè)試劑盒(上海科華生物工程股份有限公司);SABC免疫組化試劑盒，DAB染色劑(武漢博士德生物工程有限公司);S基因，βactin 及HBV 前S/S基因引物均由北京賽百勝公司合成.

　　1.2方法

　　1.2.1pUC193HBV和pcDNA3的酶切鑒定及目的基因片段的獲得過(guò)夜培養(yǎng) pUC193HBV和pcDNA3，以質(zhì)粒提取試劑盒抽提制備pUC193HBV和pcDNA3，分別以EcoRⅠ, HindⅢ單酶切pUC193HBV，以EcoRⅠ, HindⅢ雙酶切pUC193HBV和pcDNA3，瓊脂糖凝膠電泳分離目的基因，利用膠回收試劑盒回收9600 bp HBV全長(zhǎng)基因片段和線性pcDNA3.

　　1.2.2pcDNA33HBV重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定HBV DNA與 線性pcDNA3以濃度比3∶1混合，在T4 DNA連接酶作用下4℃連接16 h. 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α. 隨機(jī)調(diào)取抗性菌落，經(jīng)小量擴(kuò)增，提取質(zhì)粒，分別以EcoRⅠ, HindⅢ單酶切并以二者雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳鑒定后送北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限公司進(jìn)行序列測(cè)定.

　　2結(jié)果

　　2.1pUC193HBV, pcDNA3和pcDNA33HBV的酶切鑒定pUC193HBV雙酶切后，電泳出現(xiàn)兩條帶，片段大小約2900 bp(pUC19)和9600 bp(3HBV)，單酶切條帶均在9416 bp與23130 bp之間，pcDNA3雙酶切為5400 bp的片段. 連接產(chǎn)物雙酶切后，電泳出現(xiàn)兩條帶，分別為5400 bp(pcDNA3)和9600 bp(3HBV)，單酶切條帶均在9416 bp 與23 130 bp之間，與預(yù)期結(jié)果相符(圖1) ，且測(cè)序證實(shí)連接正確.

　　1,6: pcDNA3經(jīng)EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切; 2: pUC193HBV經(jīng)EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切; 3: pUC193HBV經(jīng)EcoRⅠ酶切; 4: pUC193HBV經(jīng)HindⅢ酶切; 5, 10: DNA marker λHindⅢ digest; 7: pcDNA33HBV經(jīng)EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切;

　　8: pcDNA33HBV經(jīng)EcoRⅠ酶切; 9: pcDNA33HBV經(jīng)HindⅢ酶切.

　　2.2抗G418細(xì)胞克隆的形成及篩選轉(zhuǎn)染后4 wk內(nèi)對(duì)照組HepG2細(xì)胞在G418的作用下全部死亡，同時(shí)轉(zhuǎn)染pcDNA33HBV組HepG2細(xì)胞陽(yáng)性克隆形成. 挑取陽(yáng)性克隆繼續(xù)用G418篩選培養(yǎng)，建立了攜帶HBV全基因的細(xì)胞系.

　　2.3ELISA法檢測(cè)HBsAg和HBeAg表達(dá)轉(zhuǎn)染pcDNA33HBV細(xì)胞組上清中HBsAg, HBeAg均陽(yáng)性，而對(duì)照組HepG2細(xì)胞上清始終為陰性.

　　3討論

　　隨著分子生物學(xué)的發(fā)展,將重組基因轉(zhuǎn)入動(dòng)物細(xì)胞并表達(dá)已成為確定和分析功能基因產(chǎn)物的有力手段，大大促進(jìn)了HBV的研究. 有研究報(bào)道，迄今用于繁殖HBV的所有組織培養(yǎng)系統(tǒng)，都是用串聯(lián)的HBV基因組，常在很強(qiáng)的外源性啟動(dòng)子的控制下，這些系統(tǒng)可用于生成大量病毒[1]. 我們構(gòu)建的pcDNA3 3HBV，含完整的頭尾串聯(lián)的HBV全基因，載體pcDNA3帶有CMV早期啟動(dòng)增強(qiáng)子，轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，能有效合成和分泌HBsAg， HBeAg. RTPCR顯示轉(zhuǎn)染細(xì)胞有HBV特異性S基因mRNA的表達(dá)，證實(shí)該轉(zhuǎn)染細(xì)胞中存在HBV轉(zhuǎn)錄、復(fù)制過(guò)程. 且轉(zhuǎn)染細(xì)胞上清中擴(kuò)增出前S/S基因，即整個(gè)S區(qū)，說(shuō)明有病毒DNA的存在. 其中前S1蛋白位于完整的病毒顆粒(Dane顆粒)表面，與病毒的裝配和感染密切相關(guān)[7]，具有與肝細(xì)胞受體結(jié)合的位點(diǎn)[1]. 由此說(shuō)明轉(zhuǎn)染細(xì)胞可分泌結(jié)構(gòu)較完整的病毒顆粒. 熒光定量PCR進(jìn)一步證明該細(xì)胞系能產(chǎn)生較高滴度的HBV DNA.