摘 要：　目的 研究異葉敗醬Patrinia heterophylla Bunge的化學成分及其生物活性。方法 異葉敗醬75%乙醇提取物采用大孔樹脂、硅膠、中壓液相、半制備高壓液相進行分離純化, 根據理化性質及波譜數據鑒定所得化合物的結構。CCK-8法檢測各化合物抑制白血病細胞HL-60、K562活性。結果 從中分離得到7個化合物, 分別鑒定為patrinoside (1) 、roseosideⅡ (2) 、 (3-O-α-L-arabinopyranosyl hederagenin 28-O-β-D-glucopyranosyl- (1→6) -β-D-glucopyranoside (3) 、apigenin4′-O-β-D-glucopyranoside (4) 、fissoside B (5) 、芹菜素-7-O-β-D-蘆丁糖苷 (6) 、rhamnocitrin 3-O-[α-L-rhamnopyranosyl (l→4) -O-α-L-rhamnopyranosyl (1→6) ]-β-D-galactopyranoside (7) 。化合物1～6的IC50<100μg/mL。結論 化合物2～6為首次從該屬植物中分離得到, 化合物1為首次從該植物中分離得到。化合物1～3、5～6對HL-60細胞具有一定的毒性抑制作用, 化合物2～6對K562細胞具有一定的毒性抑制作用。

　　關鍵詞：　異葉敗醬; 化學成分; 分離鑒定; 生物活性;

　　相關閱讀：中藥藥理與臨床雜志的查稿電話是什么?

　　異葉敗醬Patrinia heterophylla Bunge是敗醬科敗醬屬多年生草本植物, 其根莖或根與糙葉敗醬的根莖或根混用, 藥材名墓頭回[1]。文獻報道墓頭回對各類急慢性白血病細胞有抑制作用, 并且臨床上用于治療白血病[2-3]。異葉敗醬作為墓頭回的藥源植物, 對其化學成分報道較少, 為進一步明確異葉敗醬中的藥效物質基礎, 本實驗對異葉敗醬進行化學成分研究, 并對其單體化合物進行抗腫瘤活性篩選。從中分離得到7個化合物, 化合物2～6均為首次從該屬植物中分離得到, 化合物1為首次從該植物中分離得到, 化合物1～6對白血病細胞有一定的抑制作用。

　　1、 儀器與材料

　　高效液相色譜儀 (日本 Hitachi公司) ;2000ES蒸發光散射檢測器 (美國Altech公司) ;R1-102示差檢測器 (日本Shodex公司) ;NP7000半制備液相泵 (漢邦公司) ;R200旋轉蒸發儀、中壓反相色譜柱 (瑞士Buchi公司) ;Bruker AV-Ⅲ HD 600超導核磁共振儀 (瑞士Bruker公司) ;Q-TOF高分辨質譜儀 (美國Sciex公司) ; YT-CJ-1ND 超凈工作臺 (北京亞泰科隆技術有限公司) ;MCO-15ACCO2 恒溫培養箱 (日本Sanyo公司) ;DT5-2離心機 (北京時代北利離心機有限公司) ;1420-012酶標儀 (美國Perkin Elmer公司) ;ECLIPSE TS100顯微鏡 (日本Nikon公司) ;D-101大孔樹脂 (天津南開和成科技有限公司) ;薄層層析硅膠GF254、柱層析硅膠100～200目 (青島海洋化工廠) 。分析純石油醚、氯仿、丙酮、乙酸乙酯、正丁醇和甲醇等試劑 (國藥集團化學試劑有限公司) ;色譜純甲醇、乙腈 (國藥集團化學試劑有限公司) ;娃哈哈純凈水 (杭州娃哈哈公司) 。RPMI 1640 培養基 (美國Gibco公司) ;胎牛血清 (美國HyClone公司) ;二甲基亞砜 (美國Amresco公司) ;CCK-8試劑盒 (Biosharp生物科技公司) 。

　　異葉敗醬于2014年采于河南省, 經中國人民解放軍總醫院劉萍研究員鑒定為正品。

　　人早幼粒白血病細胞 (HL-60) 、人慢性粒細胞白血病細胞 (K562) 均購于中國醫學科學院腫瘤醫院細胞中心。

　　2、 提取與分離

　　干燥的異葉敗醬全草 (2 kg) 粉碎, 75%乙醇回流提取3次, 過濾后減壓濃縮得異葉敗醬總浸膏。總浸膏加水成懸浮液, 依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇各萃取3次, 取有機相層, 用旋轉蒸發儀減壓濃縮, 回收溶劑, 分別得石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇部位63、112、36、95 g。取正丁醇部分用大孔樹脂色譜進行分離, 依次用30%、60%、95%乙醇進行梯度洗脫, 減壓濃縮后得到30%、60%、95%部分浸膏。

　　將30%部分浸膏 (50 g) 經硅膠柱 (100～200 目) 分離, 以氯仿-甲醇-水 (25∶1∶0、9∶1∶0、9∶1∶0.1、8∶2∶0.2、7∶3∶0.5) 梯度洗脫, 共得到263個餾分A1-263, 通過薄層色譜檢測, 合并相同餾分。餾分A180-190合并后經硅膠柱, 以氯仿-甲醇-水 (9∶1∶0.1、8∶2∶0.2) 梯度洗脫, 再經半制備HPLC (乙腈-水 2∶8) 得化合物1 (21.5 mg) 。餾分A120-159合并后經中壓反相柱以乙腈-水 (1∶9、3∶17、1∶4、1∶3、3∶7) 梯度洗脫, 得化合物2 (12.1 mg) 。

　　將60%部分的浸膏經硅膠柱色譜 (100～200 目) 分離, 經氯仿-甲醇-水 (9∶1∶0.1、8∶2∶0.2、7∶3∶0.5) 梯度洗脫, 共得到245個餾分B1-245, 通過薄層色譜檢測, 合并相同餾分。餾分B93-100合并后經中壓反相柱以甲醇-水 (5∶95～55∶45) 梯度洗脫得化合物3 (11 mg) 。餾分B60-70號合并后經中壓反相柱以乙腈-水 (3∶97～48∶52) 梯度洗脫, F23重結晶得化合物4 (16.4 mg) , F26重結晶得化合物5 (9.1 mg) 。餾分B77-91號合并后經中壓反相柱以甲醇-水 (5∶95～80∶20) 梯度洗脫, F30重結晶得化合物6 (8.8 mg) , F40重結晶得化合物7 (10.6 mg) 。

　　3、 結構鑒定

　　化合物1:白色粉末 (甲醇) 。ESI-MS m/z:485[M+Na]+。1H-NMR (600 MHz, CD3OD) δ: 1.78 (1H, m, H-13) , 2.03 (2H, m, H-6) , 2.13 (1H, m, H-9) , 2.19 (2H, dd, J=7.2 Hz, H-12) , 2.95 (1H, q, J=7.8 Hz, H-8) , 3.15 (1H, t, J=8.4 Hz, H-7) , 3.24 (2H, m, H-10) , 4.04 (1H, d, J=11.4 Hz, H-1) , 4.22 (1H, m, H-11) ; 13C-NMR (150 MHz, CD3OD) δ: 93.5 (C-1) , 140.0 (C-3) , 116.4 (C-4) , 34.1 (C-5) , 40.9 (C-6) , 73.3 (C-7) , 49.0 (C-8) , 42.7 (C-9) , 62.2 (C-10) , 69.6 (C-11) , 103.4 (C-1′) , 75.1 (C-2′) , 78.1 (C-3′) , 71.7 (C-4′) , 77.9 (C-5′) , 62.8 (C-6′) , 173.3 (C-1″) , 44.1 (C-2″) , 26.8 (3″) , 22.6 (4″) 。以上數據與文獻[4]一致, 故鑒定為patrinoside。

　　化合物2:黃色粉末 (甲醇) 。ESI-MS m/z:677[M+Na]+。1H-NMR (600 MHz, CD3OD) δ: 2.10 (1H, d, J=16.8 Hz, H-2) , 2.47 (1H, d, J=16.8 Hz, H-2) , 5.81 (1H, quin, H-4) , 4.36 (1H, m, H-9) , 1.21 (3H, d, J=6.6 Hz, H-10) , 0.90 (3H, s, H-11) , 0.91 (3H, s, H-12) , 1.86 (3H, d, J=1.2 Hz, H-13) , 4.28 (3H, d, J=7.8 Hz, Glu-1′) ;13C-NMR (150 MHz, CD3OD) δ: 42.4 (C-1) , 50.6 (C-2) , 201.1 (C-3) , 127.1 (C-4) , 167.2 (C-5) , 79.9 (C-6) , 131.5 (C-7) , 135.2 (C-8) , 77.2 (C-9) , 21.1 (C-10) , 23.4 (C-11) , 24.6 (C-12) , 19.5 (C-13) , 102.7 (C-1′) , 75.2 (C-2′) , 78.1 (C-3′) , 71.6 (C-4′) , 77.9 (C-5′) , 62.8 (C-6′) 。以上數據與文獻[5]一致, 故鑒定為roseoside Ⅱ。

　　化合物3:白色粉末 (甲醇) 。ESI-MS m/z:951[M+Na]+。1H-NMR (600 MHz, CD3OD) δ: 3.06 (1H, dd, J=4.8 Hz, H-3) , 5.20 (1H, brs, H-12) , 4.21 (1H, d, J=8.4 Hz, H-Ara-1) , 4.29 (1H, d, J=8.4 Hz, H-Glu-1′) , 5.30 (1H, d, J=7.8 Hz, H-Glu-1) ; 13C-NMR (150 MHz, CD3OD) δ: 39.8 (C-1) , 27.0 (C-2) , 90.7 (C-3) , 40.1 (C-4) , 57.0 (C-5) , 19.3 (C-6) , 33.9 (C-7) , 40.7 (C-8) , 49.0 (C-9) , 37.9 (C-10) , 24.5 (C-11) , 123.8 (C-12) , 144.8 (C-13) , 42.8 (C-14) , 28.9 (C-15) , 24.0 (C-16) , 49.0 (C-17) , 41.8 (C-18) , 41.4 (C-19) , 36.7 (C-20) , 29.2 (C-21) , 32.4 (C-22) , 28.5 (C-23) , 16.9 (C-24) , 16.1 (C-25) , 17.8 (C-26) , 26.3 (C-27) , 178.0 (C-28) , 74.3 (C-29) , 107.1 (C-Ara-1) , 78.1 (C-Ara-2) , 72.8 (C-Ara-3) , 69.5 (C-Ara-4) , 66.3 (C-Ara-5) , 95.7 (C-Glu-1) , 73.8 (C-Glu-2) , 78.0 (C-Glu-3) , 70.9 (C-Glu-4) , 78.0 (C-Glu-5) , 69.5 (C-Glu-6) , 104.6 (C-Glu-1′) , 75.4 (C-Glu-2′) , 78.0 (C-Glu-3′) , 71.5 (C-Glu-4′) , 77.8 (C-Glu-5′) , 62.7 (C-Glu-6′) 。以上數據與文獻[6]一致, 故鑒定為 (3-O-α-L-arabinopyranosyl hederagenin 28-O-β-D-glucopyranosyl- (1→6) -β-D-glucopyranoside。

　　化合物4: 黃色晶體 (DMSO) 。ESI-MS m/z:455[M+Na]+。1H-NMR (600 MHz, CD3OD) δ: 7.95 (2H, d, J=8.4 Hz, H-2′, 6′) , 6.93 (2H, d, J=8.4 Hz, H-3′, 5′) , 6.82 (1H, s, H-3) , 5.06 (1H, d, J=7.8 Hz, H-Glu-1) , 3.76 (1H, s, H-Glu-6) ; 13C-NMR (150 MHz, CD3OD) δ: 182.0 (C-4) , 164.2 (C-7) , 162.9 (C-2) , 161.4 (C-4′) , 161.1 (C-9) , 156.9 (C-5) , 128.6 (C-2′, C-6′) , 121.0 (C-1′) , 116.0 (C-3′, C-5′) , 105.3 (C-10) , 103.1 (C-3) , 99.9 (C-Glu-1) , 99.5 (C-6) , 94.8 (C-8) , 77.2 (C-Glu-3) , 76.4 (C-Glu-5) , 73.1 (C-Glu-2) , 69.5 (C-Glu-4) , 60.6 (C-Glu-6) 。以上數據與文獻[7]一致, 故鑒定為 apigenin4′-O-β-D-glucopyranoside。

　　化合物5:白色針晶 (DMSO) 。ESI-MS m/z:483[M+Na]+。1H-NMR (600 MHz, CD3OD) δ: 5.00 (1H, m, H-10) , 4.78 (1H, s, H-10) , 4.58 (1H, s, H-1″) , 4.35 (1H, d, J=7.8 Hz, H-3) , 4.23 (1H, d, J=7.8 Hz, H-1′) , 2.42 (1H, t, J=5.4 Hz, H-1) , 2.28 (1H, m, H-7) , 1.63 (1H, d, J=9.6 Hz, H-7) , 2.12 (1H, m, H-4) , 1.95 (1H, overlap, H-4) , 1.23 (3H, s, H-8) , 0.61 (3H, s, H-9) ; 13C-NMR (150 MHz, CD3OD) δ: 150.8 (C-2) , 113.4 (C-10) , 101.1 (C-1′) , 100.9 (C-1″) , 76.6 (C-3′) , 75.2 (C-5′) , 73.3 (C-2′) , 71.8 (C-3) , 70.7 (C-4′) , 70.5 (C-3″) , 70.3 (2″) , 68.3 (C-5″) , 67.2 (C-6′) , 50.0 (C-1) , 40.3 (C-6) , 39.9 (C-5) , 31.9 (C-4) , 26.8 (C-7) , 25.8 (C-8) , 21.9 (C-9) , 17.9 (C-6″) 。以上數據與文獻[8]一致, 故鑒定為fissoside B。

　　化合物6:黃色晶體 (DMSO) 。ESI-MS m/z:577[M+Na]+。1H-NMR (600 MHz, CD3OD) δ: 1.07 (3H, d, J=6.0 Hz, H-6) , 4.54 (1H, d, J=6.0 Hz, H-1) , 5.06 (1H, d, J=7.2 Hz, H-1″) , 6.44 (1H, s, H-6) , 6.76 (1H, s, H-8) , 6.85 (1H, s, H-3) , 6.95 (2H, d, J=8.4 Hz, H-3′, H-5′) , 7.95 (2H, d, J=8.4 Hz, H-2′, H-6′) , 10.37 (1H, s, 4′-OH) , 12.95 (1H, s, 5′-OH) ;13C-NMR (150 MHz, CD3OD) δ: 17.8 (C-6) , 66.0 (C-6″) , 68.3 (C-5) , 69.5 (C-2) , 70.3 (C-3) , 70.7 (C-4″) , 72.0 (C-2″) , 73.1 (C-4) , 75.6 (C-3″) , 76.3 (C-5″) , 94.8 (C-8) , 99.5 (C-6) , 99.9 (C-1) , 100.5 (C-1″) , 103.1 (C-3) , 105.4 (C-10) , 116.1 (C-3′) , 121.0 (C-1′) , 128.6 (C-2′, C-6′) , 156.9 (C-9) , 161.2 (C-4′) , 161.3 (C-7) , 162.9 (C-5) , 164.4 (C-2) , 182.0 (C-4) 。以上數據與文獻[9]一致, 故鑒定為芹菜素-7-O-β-D-蘆丁糖苷。

　　化合物7:黃色晶體 (甲醇) 。ESI-MS m/z:807[M+Na]+。1H-NMR (600 MHz, CD3OD) δ: 3.83 (3H, s, H-7) , 5.01 (1H, d, J=7.8 Hz, H-1″) , 6.29 (1H, d, J=7.2 Hz, H-6) , 6.55 (1H, s, H-8) , 6.83 (2H, d, J=9.0 Hz, H-3′, H-5′) , 8.07 (2H, d, J=8.4 Hz, H-2′, H-6′) ;13C-NMR (150 MHz, CD3OD) δ: 179.7 (C-4) , 167.4 (C-7) , 162.7 (C-5) , 161.8 (C-4′) , 159.7 (C-9) , 158.5 (C-2) , 135.9 (C-3) , 132.6 (C-2′, C-6′) , 122.5 (C-1′) , 116.2 (C-3′) , 106.5 (C-10) , 105.5 (C-1″) , 104.0 (C-1″″) , 101.9 (C-1) , 99.2 (C-6) , 93.3 (C-8) , 79.6 (C-4) , 75.4 (C-5″) , 75.0 (C-3″) , 74.0 (C-4″″) , 73.2 (C-3″″) , 73.0 (C-2″″) , 72.2 (C-2″) , 72.1 (C-3) , 71.9 (C-2) , 70.2 (C-5″″) , 70.0 (C-5, C-4″) , 67.6 (C-6″) , 56.6 (C-OMe) , 18.0 (C-6″″) , 18.0 (C-6) 。以上數據與文獻[10]一致, 故鑒定為rhamnocitrin 3-O-[α-L-rhamnopyranosyl (l→4) -O-α-L-rhamnopyranosyl (1→6) ]-β-D-galactopyranoside。

　　4、 活性測試

　　4.1、 細胞培養

　　將細胞從液氮罐中取出, 常規方法[11-12]復蘇, 將細胞用含15%胎牛血清的RPMI 1640培養液, 在37 ℃, 5%CO2 飽和濕度條件下培養。根據不同細胞的生長速度1～2 d更換新鮮的培養液或者傳代。

　　4.2、 CCK-8檢測

　　將處于對數生長期的HL-60、K562細胞制成密度9×104/mL、8×104/mL的細胞懸液接種于96孔板中, 每孔100 μL, 每組設置5個平行孔。在培養箱中培養24 h后分別加入不同質量濃度的化合物1～6 (從低到高依次為0、20、40、60、80、100 μg/mL) 及陽性對照品順鉑50 μL。給藥后繼續在培養箱中培養48 h, 取出培養板, 每孔加入10 μL CCK-8 溶液。1～2 h (K562 1.5 h, HL-60 2 h) 后在450 nm處測OD值。并計算細胞抑制率及IC50值。

　　4.3、 對白血病細胞增殖抑制活性測定

　　各化合物的IC50值見表1。據相關文獻報道[13], 單體化合物的IC50<100 μg/mL, 表明實驗樣品具有明顯的細胞毒活性。結果顯示, 化合物1～3、5～6對HL-60細胞具有一定的毒性抑制作用, 化合物2～6對K562細胞具有一定的毒性抑制作用。

　　5、 討論

　　異葉敗醬是墓頭回最早的藥源植物[14], 是歷代本草中以墓頭回使用的主流, 但是關于異葉敗醬的化學成分報道卻很少, 目前國內外有12個三萜類、5個環烯醚萜酯、3個木脂素、2個甾體類、3個黃酮類、1個多糖和1個香豆素類化合物的報道。異葉敗醬總皂苷和粗制劑可用于治療急慢性白血病、子宮癌、宮頸癌和大腸癌[15], 但是其發揮藥效的確切化合物尚未確定。本研究從異葉敗醬中分離得到7個化合物, 其中化合物1為環烯醚萜類、化合物2為單環降倍半萜苷類、化合物3為三萜皂苷類、化合物5為單萜類龍腦苷、化合物4、6～7為黃酮類。通過CCK-8法篩選了化合物1～6對HL-60和K562細胞的增殖抑制作用。結果顯示, 各單體化合物對白血病細胞具有一定的毒性抑制作用, 且化合物1～3、5～6對HL-60細胞、化合物2～6對K562細胞的抑制作用與藥物質量濃度有一定的依賴關系, 以期為今后進一步研究異葉敗醬的抗白血病作用提供參考。雖然單體化合物對白血病細胞表現出了體外毒性, 但中藥成分復雜, 異葉敗醬化學成分抗白血病作用的確切機制還需進一步研究。

　　表1 各化合物抗白血病細胞IC50值 (μg/mL)

　　參考文獻

　　[1] 陳虎彪, 誠靜容.國產敗醬科藥用植物種類整理[J].中國中藥雜志, 1994, 19 (2) :67-70.

　　[2] 萬增智, 楊文華, 史哲新, 等.墓頭回對HL-60細胞誘導分化作用的實驗研究[J].中國中醫藥科技, 1999, 6 (6) :415.

　　[3] 程衛東, 李立.墓頭回提取物誘導K562細胞凋亡的實驗研究[J].北京中醫藥大學學報, 2007, 30 (1) :51-53.

　　[4] Nishiya K, Kimura T, Takeya K, et al.Sesquiterpenoids and iridoid glycosides from Valeriana fauriei[J].Phytochemistry, 1992, 31 (10) :3511-3514.

　　[5] Otsuka H, Yao M, Kamada K, et al.Alangionosides G-M:glycosides of megastigmane derivatives from the leaves of Alangium premnifolium[J].Chem Pharm Bull (Tokyo) , 1995, 43 (5) :754-759.

　　[6] Haruhisa K, Satoshi H, Mizumi S, et al.Studies on the constituents of Hedera rhombea BEAN.Ⅳ.on the hederagenin glycosides. (2) [J].Chem Pharm Bull, 1985, 33:3473-3478.

　　[7] Teng R W, Xie H Y, Li H Z, et al.Two new acylated flavonoid glycosides from Morina nepalensis var.alba Hand.-Mazz[J].Magn Reson Chem, 2002, 40:415-420.

　　[8] Wang M, Zhang Y, Zhang H, et al.The active glycosides from Urtica fissa rhizome decoction[J].J Nat Med, 2018, 72 (2) :557-562.

　　[9] 田瑛, 劉細橋, 董俊興.中藥地錦草芹菜素糖苷類化合物[J].藥學學報, 2009, 44 (5) :496-499.

　　[10] Lin C N, Chung M I, Gan K H, et al.Flavonol and anthraquinone glycosides from Rhamnus formosana[J].Phytochemistry, 1991, 30 (9) :3103-3106.