AFM的高分辨成像和簡便的樣品制備過程吸引了眾 多學(xué)者利用它對染色體結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究。但早期由于鑲嵌于30nm蛋白質(zhì)層的RNA吸附在染色體的表面 [19] ，同時鹽、細(xì)胞殘渣等隨同染色體滴片時吸附于玻片上 [20] ，妨礙染色體表面更細(xì)微的結(jié)構(gòu)成像。

　　關(guān)鍵詞：原子力

　　1 原子力顯微鏡工作原理

　　原子力顯微鏡(Atomic force microscopy，AFM)是一種以物理學(xué)原理為基礎(chǔ)，通過掃描探針與樣品表面原子相互作用而成像的新型表面分析儀器。它屬于繼光學(xué)顯微鏡、電子顯微鏡之后的第三代顯微鏡。AFM通常利用一個很尖的探針對樣品掃描，探針固定在對探針與樣品表面作用力極敏感的微懸臂上。懸臂受力偏折會引起由激光源發(fā)出的激光束經(jīng)懸臂反射后發(fā)生位移。檢測器接受反射光，最后接受信號經(jīng)過計算機(jī)系統(tǒng)采集、處理、形成樣品表面形貌圖像。早期研制的為接觸式原子力顯微鏡，它包括恒力模式和恒高模式。前者利用反射光位移引起的光電二極管輸出電壓的變化構(gòu)成反饋回路控制壓電陶瓷管伸縮，從而調(diào)節(jié)固定于掃描器上樣品的位置，保持樣品和探針間作用力(懸臂彎曲度)不變，測量每一點高度的變化。后者保持樣品和探針間的距離不變，測量每一點作用力的大小。這種模式在調(diào)節(jié)探針與樣品距離前即可直接觀測懸臂彎曲度的改變。除傳統(tǒng)的接觸式之外，1993年又研制出輕敲式原子力顯微鏡。該顯微鏡在掃描過程中探針與樣品表面輕輕接觸，懸臂受存在于兩者間的排斥力作用隨樣品表面起伏發(fā)生高頻振顫。由于探針與樣品的接觸短暫，因此它更適用于質(zhì)地脆或固定不牢的樣品 [1] 。

　　2 原子力顯微鏡的應(yīng)用

　　在AFM誕生最初的一段時間主要應(yīng)用于電化學(xué)、材料科學(xué)等領(lǐng)域。近些年，人們逐漸探索著運用AFM對生物樣品進(jìn)行納米水平的觀測及顯微操作等。與其它顯微鏡相比，AFM的納米量級的高空間分辨率尤為突出，橫向分辨率可達(dá)0.1～0.2nm，縱向分辨率高達(dá)0.01nm。此外，它不但能夠?qū)ι頎顟B(tài)下的樣品成像，而且可以實時動態(tài)地研究樣品結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系。故而，AFM成為納米尺度上研究物質(zhì)結(jié)構(gòu)、特性和相互作用的有力手段。以下主要對這項納米技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域中取得了顯著的成績作一綜述。

　　2.1 形態(tài)結(jié)構(gòu) 作為新興的形態(tài)結(jié)構(gòu)成像技術(shù)，AFM實現(xiàn)了對接近自然生理條件下生物樣品的觀察。這主要由于它具備以下幾個特點:(1)與掃描電鏡和透射電鏡這些高分辨的觀測技術(shù)相比，樣品制備過程簡便，可以不需染色、包埋、電鍍、電子束的照射等處理過程;(2)除對大氣中干燥固定后樣品的觀察外，還能對液體中樣品成像;(3)可以根據(jù)觀察者的要求，調(diào)節(jié)樣品所處的溫度、濕度、大氣、真空等觀察條件。目前，AFM已廣泛地應(yīng)用于細(xì)胞及蛋白、多糖、核酸等生物大分子結(jié)構(gòu)的研究中。對一個細(xì)胞而言，AFM不但能夠提供長度、寬度、高度等形態(tài)方面的信息，還可以滿足人們對膜上的離子通道、絲狀偽足、細(xì)胞間連接等細(xì)微結(jié)構(gòu)的研究 [2，3] ，甚至還可清楚地觀察到膜身的骨架結(jié)構(gòu) [4] 。后者對細(xì)胞表面與表面下結(jié)構(gòu)相互作用的進(jìn)一步研究非常有利。Qian [5] 等利用AFM對酵母的熱休克蛋白Sis1與Ssa1進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)只有Ssa1的lid區(qū)一端與Sis1縮氨酸結(jié)合區(qū)作用，并且Sis1二聚體的縮氨酸結(jié)合區(qū)呈現(xiàn)較高水平的凹槽結(jié)構(gòu)，這有助于闡明蛋白相互作用機(jī)制及其在蛋白折疊、組裝、降解、轉(zhuǎn)移中的重要作用。定的生理生化反應(yīng)會引起生物樣品空間結(jié)構(gòu)的變化。利用AFM對這些變化的觀察，為細(xì)胞結(jié)構(gòu)及結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)的生理意義等研究提供更多有價值的信息。例如Liu [6] 等將大麥的中期染色體經(jīng)嚴(yán)格點干燥、2M NaCl處理后提取出2種非組蛋白。通過AFM在納米水平顯示提取蛋白后染色體的三維結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)處理后的染色體發(fā)生下列變化:高度降低同時表面較前粗糙。又如:Sit [7] 將纖維蛋白原固定在3種不同基底表面，研究樣品發(fā)生的結(jié)構(gòu)變化。由AFM的三維定量分析顯示纖維蛋白原按照mica

　　2.2 力學(xué)特性 由于利用AFM可對掃描各點高度及作用力的測量，這就意味著我們不僅可以獲取生物樣品的表面形態(tài)和三維結(jié)構(gòu)，還可以得到其表面硬度、粘彈性、摩擦力等力學(xué)特性的表面圖譜 [10] 。例如AFM在掃描樣品時，探針尖端作用樣品可使樣品產(chǎn)生可測量的凹陷。當(dāng)應(yīng)力與應(yīng)變力成線性關(guān)系時，樣品發(fā)生的變形屬彈性變化，即撤銷力時樣品可恢復(fù)原有形態(tài)。我們利用凹陷的深度數(shù)據(jù)就能夠獲取有關(guān)樣品局部的彈性信息。Alcaraz [11] 等利用AFM測量支氣管上皮和肺泡上皮細(xì)胞在不同負(fù)荷力和作用頻率下的復(fù)剪切彈性系數(shù)，觀察其變化規(guī)律。在樣品表面性能測量中，應(yīng)該考慮到探針可能同時會受到其他作用而影響實驗數(shù)據(jù)。在該實驗中作者就針對溶液粘性牽拉力及與樣品接觸的探針幾何形狀引起的偏差予以校正，使測量結(jié)果更準(zhǔn)確。

　　2.3 分子間力 將很高的空間分辨率與敏感且準(zhǔn)確的力學(xué)感應(yīng)性相結(jié)合，是AFM的一個極為顯著的特點。通過將探針連接在彈性系數(shù)很小的懸臂上，AFM對力的測量敏感性可達(dá)到pn水平。到目前為止，AFM已經(jīng)廣泛地運用于測量溶液中生物分子間相互作用如與生物反應(yīng)有關(guān)的水合力的研究 [12] 。利用這些研究結(jié)果還有助于對生物分子結(jié)構(gòu)和機(jī)械性能進(jìn)行分析。例如，蛋白質(zhì)依靠多種非共價作用而保持其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，通過機(jī)械或化學(xué)的方法將蛋白伸展后，可以利用AFM直接測量穩(wěn)定蛋白結(jié)構(gòu)的作用力，并進(jìn)一步探究這些力對蛋白結(jié)構(gòu)的影響。近幾年AFM對肌蛋白titin的去折疊研究取得的顯著成果即有力地說明了這一點 [13]另外，AFM還能夠測量單個分子間微弱的非共價力。例如測量受體-配體的去結(jié)合力，若受體固定在基底表面的話，則將與之對應(yīng)的配體固定于探針表面，使探針功能化。隨探針-樣品的距離逐漸縮小，懸臂受探體-樣品間吸引或排斥力的作用向接近或遠(yuǎn)離樣品的方向偏折，懸臂偏折的最大幅度反映分離緊密結(jié)合兩分子所需的力。在測量中，有可能會受到探針與表面的非特異性相互作用的干擾 [14] 。因此，有必要認(rèn)真地選擇對照實驗包括使用未功能化探針;或基底所處的溶液中利用游離的配體封閉受體;調(diào)節(jié)溶液的離子強(qiáng)度或pH，降低靜電力的干預(yù) [15] 。除此之外，探針還有可能受溶液粘性牽拉力作用，使撤離速率減慢至記錄數(shù)據(jù)低于實際的作用力。

　　2.4 顯微操作 通過在納米級水平調(diào)控探針的位置和施加力，AFM可以實現(xiàn)對生物分子進(jìn)行物理操作如切割生物結(jié)構(gòu)，轉(zhuǎn)移分子至特定位置。在一定的范圍調(diào)整施加力，AFM在成像的同時即可對樣品進(jìn)行操作。施加力的范圍主要由懸臂的力學(xué)常數(shù)和探針粗細(xì)決定。與標(biāo)準(zhǔn)顯維切割技術(shù)相比，AFM對目標(biāo)區(qū)域切割、提取等操作具有更準(zhǔn)確的特點。1992年Hansma [16] 利用AFM切割遺傳物質(zhì)DNA分子的特定位置，這是人們首次使用AFM對生物分子進(jìn)行的可控性納米操縱。隨后它在生物膜的切割 [17] 、待研究分子的分離 [18] 等方面也得到廣泛的應(yīng)用。

　　3 AFM在染色體研究方面的進(jìn)展

　　近來隨著染色體制備方法的改善和AFM成像技術(shù)的提高，該方面的研究得到進(jìn)一步的發(fā)展。染色體經(jīng)胃蛋白酶、RNA酶依次作用后，置于溶液中觀察，不僅去除了表面的蛋白質(zhì)層，而且再次水化后染色體體積增大5～7倍，能夠分辨出樣品表面的染色質(zhì)纖維所形成的環(huán)狀結(jié)構(gòu) [19] 。最近利用該方法使染色體成像橫向和縱向分辨率分別可達(dá)到1nm、0.1nm，并且發(fā)現(xiàn)染色質(zhì)纖維是由放射狀排列染色質(zhì)環(huán)與盤繞的螺旋管狀結(jié)構(gòu)共同組成 [21] 。在G、C分帶中期染色體的三維結(jié)構(gòu)觀察 [7] ，染色單體型畸變識別 [8] ，核型分析等方面研究的應(yīng)用證實了與光學(xué)顯微鏡、掃描及透射電鏡等成像工具相比AFM具備獨特的優(yōu)勢:它不僅能夠識別染色體畸變，同時可以對結(jié)構(gòu)變化進(jìn)行細(xì)微的觀察。除正常染色體的結(jié)構(gòu)及表面性質(zhì)的研究，AFM還對G分帶染色體形態(tài)發(fā)生的一系列變化進(jìn)行觀察。研究發(fā)現(xiàn)隨胰蛋白酶作用時間的延長，染色體除周邊之外的其余結(jié)構(gòu)將逐漸發(fā)生崩解 [22] 。中期染色體經(jīng)G、C分帶會出現(xiàn)縱向高度的差異 [23，24] ，各條帶中染色質(zhì)纖維排列的松緊度也有所不同 [25] 。這些都有助于染色體分帶機(jī)制的闡明。對重離子射線誘發(fā)染色體畸變分析發(fā)現(xiàn)AFM不但識別出染色單體裂隙和單體斷裂，還清楚觀察到單體型畸變的斷裂點纖維狀結(jié)構(gòu) [26] 。這證實了AFM是輻射誘發(fā)染色體畸變的結(jié)構(gòu)研究中十分有用的工具。可見，AFM已在染色體結(jié)構(gòu)、物理性質(zhì)等方面研究獲得很大的進(jìn)展。另外，作為一種納米操縱工具，AFM還被用于納米切割染色體，提取DNA制作FISH實驗的探針等 [27] 。在亞細(xì)胞水平結(jié)構(gòu)研究的基礎(chǔ)上，發(fā)揮AFM連接亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)、分子水平研究的橋梁作用，它有可能在基因定位和功能研究等方面得到進(jìn)一步的應(yīng)用與發(fā)展。綜上，憑借它對染色體納米量極的成像和顯微操縱，AFM有希望成為結(jié)合細(xì)胞遺傳學(xué)和分子遺傳學(xué)的有力工具。

　　4 展望

　　1986年，AFM作為一種新的成像技術(shù)被研制成功。在之后短短的十余年里它由原有的納米水平單分子成像，逐漸擴(kuò)展到表面功能的研究，分子間力的測量，可控性分子操作等多個領(lǐng)域。當(dāng)然，不容忽視，在上述的AFM多種應(yīng)用中仍存在一些有待進(jìn)一步完善、解決的問題，也就是說，作為一個新興的研究工具，它同樣也存在著自身的不足。除了在實驗中不斷地分析、探求更好的解決方法之外，我們更應(yīng)該將AFM與其他成像工具相結(jié)合，取長補(bǔ)短，以便能夠更大程度地挖掘其內(nèi)在潛力，使AFM在生物醫(yī)學(xué)研究中做出更大的貢獻(xiàn)。相信隨著這項多功能技術(shù)的相關(guān)工作的不斷發(fā)展，它會為形態(tài)結(jié)構(gòu)、表面功能、相互作用力等方面研究提供更多、更重要的新發(fā)現(xiàn)。