【摘要】 目的 探討B(tài)cl-2的表達(dá)與甲狀腺癌的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后的關(guān)系。方法 應(yīng)用免疫組化方法，以單克隆抗體鼠抗人Bcl-2標(biāo)記77例甲狀腺癌、58例甲狀腺腺瘤、40例癌旁甲狀腺組織和28例正常甲狀腺組織。觀察不同甲狀腺組織中Bcl-2的表達(dá)，并比較其陽性率。結(jié)果 Bcl-2陽性反應(yīng)見于甲狀腺癌、甲狀腺腺瘤及癌旁甲狀腺組織。在甲狀腺癌組織中Bcl-2陽性率為45.5%，高于甲狀腺腺瘤組織(22.4%)(P=0.006)、癌旁甲狀腺組織(17.5%)(P=0.003)和正常甲狀腺組織(0)(P=0.000)。甲狀腺未分化癌和濾泡狀癌組織中Bcl-2的陽性率明顯增高。存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床Ⅲ、Ⅳ期病例中，Bcl-2的陽性率明顯增高。結(jié)論 Bcl-2過量表達(dá)可能與甲狀腺腫瘤的發(fā)生有關(guān)，癌組織中Bcl-2的表達(dá)可作為甲狀腺癌預(yù)后的參考指標(biāo)。文章發(fā)表在《中國醫(yī)學(xué)工程》上，是醫(yī)學(xué)職稱論文發(fā)表范文，供同行參考。

　　【關(guān)鍵詞】 甲狀腺腫瘤;Bcl-2基因;原癌基因;基因表達(dá);免疫組化

　　甲狀腺癌是常見的內(nèi)分泌腫瘤，女性發(fā)病率高。臨床甲狀腺腫瘤中有5%~10%為甲狀腺癌[1]。其中分化型甲狀腺癌占90%，包括甲狀腺乳頭狀癌和甲狀腺濾泡狀癌，未分化癌較為少見，其惡性程度高、預(yù)后差。國內(nèi)資料顯示我國甲狀腺癌的發(fā)病率在明顯增加[2]。近年來，甲狀腺癌的相關(guān)基因和腫瘤標(biāo)志物研究進(jìn)展很快。研究證實(shí)[3,4]，Bcl-2基因是一種細(xì)胞凋亡抑制基因，最早發(fā)現(xiàn)于濾泡性B細(xì)胞性淋巴瘤中，其產(chǎn)物Bcl-2蛋白可抑制細(xì)胞凋亡，延長細(xì)胞生存期。本研究采用免疫組化技術(shù)，通過檢測Bcl-2在甲狀腺癌組織、甲狀腺腺瘤組織、甲狀腺癌旁組織及正常甲狀腺組織中的表達(dá)水平，探討B(tài)cl-2在甲狀腺癌組織中的發(fā)生發(fā)展過程中的作用，以揭示Bcl-2與甲狀腺癌的生物學(xué)行為的關(guān)系及其預(yù)后關(guān)系。

　　1 材料與方法

　　1.1 材料

　　全部標(biāo)本取自北京大學(xué)深圳醫(yī)院普通外科2001年至2009年間手術(shù)治療的甲狀腺病例標(biāo)本，其中：甲狀腺癌77例(男28例，女8例，平均50歲)，58例甲狀腺腺瘤(男22例，女36例，平均36歲)，同時(shí)取癌旁甲狀腺組織40例(男10例，女30例，平均37歲，經(jīng)病理檢查確診均無甲狀腺癌浸潤);取正常甲狀腺組織28例(男9例，女l9例，平均35歲)。對77例甲狀腺癌按WHO標(biāo)準(zhǔn)組織學(xué)分類：乳頭狀癌55例，濾泡狀癌l4例，未分化癌8例，按AJCC標(biāo)準(zhǔn)臨床病理分期：I期30例，Ⅱ期23例，Ⅲ 期16例，Ⅳ期8例;其中，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者33例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者44例。標(biāo)本經(jīng)10% 福爾馬林液固定、石蠟包埋，常規(guī)切片，60℃烤片2 h，37℃過夜備用。

　　1.2 免疫組化試劑

　　Bcl-2鼠抗人單克隆抗體，為美國ZYMED公司產(chǎn)品。SP-9000通用型試劑盒為美國ZYMED公司產(chǎn)品。用已知Bcl-2陽性的扁桃體作陽性對照，以PBS代替一抗作陰性空白對照。

　　1.3 試驗(yàn)方法

　　切片脫蠟水化后，3%H2O2室溫處理15 min，微波抗原修復(fù)，正常山羊血清室溫孵育30 min，滴加一抗，4℃冰箱孵育過夜。滴加生物素標(biāo)志的二抗，室溫孵育30 min，滴加辣根過氧化酶標(biāo)記的鏈親和素室溫30 min，DAB顯色。經(jīng)蘇木精復(fù)染后，脫水、透明、封片。

　　1.4 判斷標(biāo)準(zhǔn) Bcl-2定位于細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)，以細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)黃色至深棕黃色顆粒為陽性細(xì)胞。無陽性細(xì)胞為Bcl-2陰性;有陽性細(xì)胞為Bcl-2陽性。所有標(biāo)本均由兩位病理醫(yī)師采用盲法閱片，結(jié)果不一致時(shí)協(xié)調(diào)統(tǒng)一判斷最終結(jié)果。

　　1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

　　所有數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件包在電腦上進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，進(jìn)行χ.2檢驗(yàn)，以P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

　　2 結(jié)果

　　2.1 Bcl-2在不同甲狀腺組織中的表達(dá)情況,見表1。

　　光鏡下Bcl-2陽性反應(yīng)表現(xiàn)為細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)染成棕褐色，未見棕褐色顆粒為陰性。Bcl-2陽性率在甲狀腺癌為45.5%，高于甲狀腺腺瘤(22.4%)(P≤0.01)及癌旁甲狀腺組織(17.5%)(P≤0.01)，而正常甲狀腺組織染色陰性。見表1。

　　2.2 甲狀腺癌中Bcl-2表達(dá)與甲狀腺癌有關(guān)病理指標(biāo)的關(guān)系，見表2。Bcl-2的表達(dá)程度與甲狀腺癌組織學(xué)類型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況和臨床病理分期有顯著關(guān)系。在惡性度較高的未分化癌和濾泡狀癌中，Bcl-2陽性率明顯高于惡性度較低的乳頭狀癌;在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病例或臨床Ⅲ 、Ⅳ期病例，Bcl-2陽性率高于相應(yīng)的無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床I、Ⅱ期病例，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。

　　3 討論

　　細(xì)胞凋亡又稱細(xì)胞程序化死亡，受基因調(diào)控，調(diào)控基因大體分為凋亡抑制基因和凋亡促進(jìn)基因，二者此消彼長，共同調(diào)節(jié)細(xì)胞的凋亡， 對其研究將是解決細(xì)胞凋亡機(jī)制的根本。但迄今為止其確切作用機(jī)制仍不完全清楚。

　　bcl-2基因家族在凋亡的調(diào)節(jié)中起重要作用，是研究熱點(diǎn)之一。Bcl-2基因即B細(xì)胞淋巴瘤/白血病基因-2(B-cell lymphoma/leukemia-2)，是Tsujimoto等[5]于1984年首次在濾泡型B淋巴瘤中發(fā)現(xiàn)，由此命名Bcl-2。正常位于18號(hào)染色體的長臂2區(qū)1帶，開始是通過染色體易位(14，18)斷裂點(diǎn)的分子克隆方法，從濾泡型淋巴細(xì)胞瘤中分離出來的，被人們認(rèn)為是人類濾泡型淋巴細(xì)胞瘤的細(xì)胞遺傳學(xué)標(biāo)志，由2個(gè)外顯子組成，其基因產(chǎn)物在人類中的表達(dá)與細(xì)胞壽命長短相關(guān)。近年來，人們通過廣泛的研究發(fā)現(xiàn)，Bcl-2基因有阻滯細(xì)胞凋亡發(fā)生的作用，故被認(rèn)為是抗細(xì)胞凋亡基因[6]。其抑制凋亡的機(jī)制，以前報(bào)道籠統(tǒng)說通過阻止細(xì)胞凋亡信號(hào)傳輸?shù)淖詈蠊餐范鹱饔谩Ｍㄟ^對bcl-2結(jié)合蛋白和bcl-2同源蛋白的研究，對bcl-2家族調(diào)控凋亡的基本模式有了新的認(rèn)識(shí)。bcl-2同源蛋白包括bcl-2、bcl-xL、bax、bad以及線蟲的ced-9，bcl-2、bax可以以同二聚體形式存在，也可形成異二聚體，bax同源二聚體形成，誘導(dǎo)凋亡，bax--bcl-2異二聚體形成，抑制凋亡;而當(dāng)bcl-xs存在時(shí)，優(yōu)先與bcl-2形成異二聚體，使bax得以游離形成同二聚體，誘導(dǎo)凋亡，因此，有時(shí)bcl-2表達(dá)并不一定抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生。一般認(rèn)為，bcl-2基因表達(dá)與瘤細(xì)胞的分化程度及增殖能力有關(guān)，分化程度低，增殖能力強(qiáng)的瘤細(xì)胞，其bcl-2呈現(xiàn)出過量表達(dá)趨勢。本研究中，作者系統(tǒng)地檢測了甲狀腺癌組織、甲狀腺腺瘤組織、甲狀腺癌旁組織及正常甲狀腺組織等多種甲狀腺組織中Bcl-2的表達(dá)情況，顯示在甲狀腺癌組織Bcl-2的表達(dá)率為45.5%，顯著高于甲狀腺腺瘤組織(22.4%，P=0.006)、甲狀腺癌旁的組織(17.5%，P=0.003)及正常甲狀腺組織(0，P=0.000)，揭示出甲狀腺腺瘤的濾泡上皮細(xì)胞bcl-2陽性染色強(qiáng)度及陽性細(xì)胞數(shù)較正常甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞增強(qiáng)增多，甲狀腺癌又超過腺瘤，提示bcl-2可能在調(diào)節(jié)甲狀腺上皮的凋亡中伴演重要角色，在甲狀腺癌中有更多的上皮細(xì)胞具有逃避凋亡的能力，甲狀腺癌的發(fā)生可能與bcl-2過量表達(dá)有關(guān)。研究表明，對于甲狀腺癌，腫瘤組織學(xué)類型、年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況及臨床病理分期是評估預(yù)后的主要指標(biāo)[7、8]。本組研究結(jié)果表明，在分化程度很低的未分化癌和相對較低的濾泡狀癌中，Bcl-2的表達(dá)率分別為100%與78.6%，明顯高于乳頭狀癌Bcl-2的表達(dá)率(29.1%)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病例或III、IV期甲狀腺癌病例中，癌組織中Bcl-2的表達(dá)明顯增強(qiáng)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Bcl-2在甲狀腺癌所有類型中均有表達(dá)，并且分化越差表達(dá)程度越高，因此，有理由認(rèn)為，Bcl-2陽性提示甲狀腺癌預(yù)后較差，并且表達(dá)程度越高預(yù)后也就越差。癌組織Bcl-2高表達(dá)與甲狀腺癌的分化程度、組織學(xué)亞型、增值侵襲能力、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及預(yù)后有關(guān)，可作為判斷甲狀腺癌預(yù)后的一個(gè)重要參考指標(biāo)。因此，對于甲狀腺腺瘤患者，作腫瘤組織Bcl-2檢測并對陽性病例進(jìn)行密切隨訪可能具有重要意義。

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