摘要：白背葉根為大戟科野桐屬植物白揪的根，在我國分布較廣，資源豐富。異名白膜根、野桐根，味微苦、澀、性平，有清熱、利濕、固脫、消淤等功效。民間常用鮮根水煎服治療急慢性肝炎。動物實驗證實白背葉根具有較好的抗肝纖維化、抗肝炎和抗肝傷作用〔1，2〕，為進一步了解白背葉根對HBV復制的影響，我們用HepG2.2.15細胞株為模型，觀察白背葉根體外抗HBV活性，并對其作用機理初步探討。
關鍵詞：白背葉根, 抗乙型肝炎病毒, HepG2.2.15細胞
目的觀察白背葉根體外抗乙型肝炎病毒(HBV)的活性。方法以HepG2.2.15細胞株為模型，用微粒酶免疫測定技術(MEIA)檢測細胞培養上清液中HBsAg、HBeAg含量，用PCR熒光定量技術檢測細胞上培養上清液中HBV DNA的變化，以MTT比色法觀察藥物的細胞毒性。
結果白背葉根對HepG 2.2.15細胞的TC50為48.25 mg/ml，對抑制HepG2.2.15細胞分泌HBsAg和HBeAg的治療指數分別為13.26和43.08。對HBVDNA僅有微弱抑制作用。結論白背葉根在體外細胞培養中具有直接抗HBV活性。
1 材料與方法
1.1 藥物白背葉根煎煮，水浴蒸發濃縮為2 g/ml，以8層細紗布粗濾后，經1 500 r/min離心10 min，上清液再用定性過濾液紙粗濾，25℃下測pH值為5.09，調節pH值為7.09，再經0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，置于4℃存放備用。干擾素α1b(賽若金)由深圳科興生物工程股份有限公司提供，10萬IU/支(實驗用藥)。
1.2 細胞培養Hep G 2.2.15細胞來自南方醫科大學(原第一軍醫大學)全軍病毒性肝炎重點實驗室。將HepG 2.2.15細胞接種于DMEM混合培養液(含20%胎牛血清、0.03%L谷氨酰胺、100 U/ml青霉素、100 U/ml鏈霉素、380 μg/mlG418)，置于37℃、飽和濕度、5%CO2培養箱中培養。換液1次/3 d，6~10 d傳代。每次換液留取上清，檢測HBVDNA分泌情況，表達穩定后開始實驗。
1.3 藥物對HepG 2.2.15細胞的毒性實驗根據Sargent JM等〔3〕建立的MTT比色分析法，判定各孔中存活細胞增殖代謝情況及細胞毒性反應。將白背葉根提取液用DMEM混合培養液分別稀釋成1 000，500，250，125，62.5，31.25，15.63，7.82，3.91，1.96 mg/ml和1 000，500，250，125，62.5，31.25，15.63，7.82，3.91，1.96 μg/ml等20個實驗濃度，培養細胞用胰蛋白酶消化，配制成濃度為10×104/ml的細胞懸液接種于96孔培養板，每孔0.1 ml，37℃、飽和濕度、5%CO2培養，于48 h后換入不同濃度含藥DMEM混合培養液，同時設無藥物細胞對照組，每濃度4孔，每4天換新鮮含藥培養液，共2次。第8天每孔加入MTT溶液(1 mg/ml)200 μl，繼續在37℃下孵育4 h，終止培養，小心吸棄孔內培養上清，然后每孔加入150 μl DMSO，震蕩10 min，使結晶物充分溶解，置入酶聯檢測儀中以570 nm波長測定各孔光吸收值(OD值)，重復3次，依照ReedMuench法〔4〕計算藥物對HepG 2.2.15細胞的抑制百分率(%)=(細胞對照組平均A組-實驗組平均A值)/細胞對照組平均A值×100%;細胞半數有毒濃度(TC50)=Antilg〔lgB+(50-B)的抑制百分率/(A-B)的抑制百分率)×C〕×100%，治療指數(TI)=半數有毒濃度(TC50)/半數有效濃度(IC50)。TI>2為有效低毒，12為低效低毒，TI<2為毒性作用。注：A=lg>50%藥物濃度，B=lg<50%藥物濃度，C=lg稀釋倍數。
1.4 藥物應用培養細胞用胰島蛋白酶化，配制成濃度為10×104/ml的細胞懸液接種于24孔培養孔，每孔1 ml，37℃、飽和濕度、5%CO2培養，根據藥物毒性度驗結果，于48 h后換入6種不同濃度(31.25，15.63，7.82，3.91，1.96，0.98 mg/ml)的細胞全培養液，陽性對照藥物為干擾素α1b(賽若金100，200，400IU)，同時設不含藥物的細胞對照組。每4天換新鮮含藥培養液，共2次，于第4，8天留取培養液作為檢測標本-20℃保存，同批次試劑同一時間檢測。
1.5 上清液中HBsAg，HBeAg的檢測采用微粒酶免疫(MEIA)測定技術(美國Abbott公司AXSYM全自動免疫分析系統及試劑盒)檢測，結果以S/CO值表示。抑制率=(細胞對照組S/CO值-藥物組S/CO值)/細胞對照組/S/CO值×100%。
1.6 上清液中HBVDNA的提取及定量檢測采用PCR熒光定量技術檢測上清液中HBV DNA定量。每個濃度重復測定3次，取平均值。HBV DNA抑制百分率(%)=(細胞對照組平均A值-實驗組平均A值)/細胞對照組平均A值×100%。
1.7 統計學分析結果用±s表示，組間比較用方差分析，采用SPSS11.0完成。
