【摘要】大鼠胰腺經(jīng)膠原酶消化及純化后，獲得分散較好、純度較高的胰島，呈圓形或橢圓形，胰島結(jié)構(gòu)完整，界限清楚，鏡下為不透光實體，雙硫腙染色呈深紅色(圖1)，表明為含有β細胞的胰島細胞團，每只大鼠胰腺平均獲得直徑在100~300 μm之間的胰島約為(337.80 ±21.36)個.

　　【關(guān)鍵詞】 胰島;細胞，培養(yǎng)的;大鼠;胰島素;時間反應(yīng)曲線

　　目的： 探討外源性胰島素對離體大鼠胰島第一時相胰島素分泌的影響. 方法： 雄性SD大鼠胰腺采用Ⅴ型膠原酶經(jīng)胰管灌注消化分離得到胰島，用100 μU/mL外源性胰島素分別孵育0， 60，120和240 min(n=8)后，給予葡萄糖刺激，分別測定0，3，5，10和30 min胰島素分泌量. 結(jié)果： 不同時間胰島素預處理后，各組在葡萄糖刺激時均產(chǎn)生胰島素第一時相分泌(P0.05)，但隨著胰島素孵育時間的延長，胰島素第一時相分泌峰值降低(P0.01). 結(jié)論：100 μU/mL外源性胰島素損害胰島素第一時相分泌，且孵育時間越長，抑制程度越明顯.

　　正常人的β細胞受到葡萄糖負荷刺激時呈雙相式胰島素分泌. 第一時相胰島素分泌表現(xiàn)在β細胞受到葡萄糖刺激后l min開始，3～5 min時達峰值，持續(xù)約10 min. 第一時相胰島素分泌雖然短暫，但在調(diào)節(jié)血糖水平中具有重要的生理意義. 葡萄糖誘導的胰島素第一時相分泌受損是胰島β細胞功能障礙的最早標志〔1〕，并預示著2型糖尿病的發(fā)生. 目前外源性胰島素對胰島β細胞胰島素分泌的作用尚無定論，有關(guān)對胰島素第一時相分泌的影響的研究報道也較少. 本研究通過觀察離體胰島在外源性胰島素預處理后對葡萄糖刺激的第一時相分泌的變化，為進一步探討外源性胰島素對于胰島β細胞胰島素第一時相分泌的影響提供依據(jù).

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　雄性SD大鼠35只，體質(zhì)量 250～300 g，購于第四軍醫(yī)大學試驗動物中心. 膠原酶V， Histopaque1077， 雙硫腙購于美國Sigma公司;胰島素放免試劑盒購于北京北免東雅公司;RPMI1640，小牛血清購于Gibco公司; 其他試劑均為國產(chǎn)分析純. 膠原酶Ⅴ溶液含NaCl 124 mmol/L，KCl 4.7 mmol/L，CaCl2 7.5 mmol/L，MgSO4·7H2O 1.2 mmol/L，KH2PO4 1.2 mmol/L，NaHCO3 2.4 mmol/ L，葡萄糖3 mmol/L，HEPES 10 mmol/L，V型膠原酶 0.60 g/L(pH 7.8).

　　1.2方法

　　1.2.1胰島的分離及純化

　　固定大鼠后備皮，200 g/L烏拉坦7 mL/kg腹腔注射麻醉. 剖腹充分暴露胰腺,于無菌條件下膽總管內(nèi)插入4.5號頭皮針，逆行注入預冷的膠原酶Ⅴ溶液8～10 mL，使胰腺膨脹，迅速摘取整個胰腺，38℃水浴中靜止消化10 min. 振蕩15 s使其呈細砂狀，充分分散胰腺組織，再加入4℃小牛血清10 mL與4℃ Hanks液30 mL終止消化. 40目篩網(wǎng)過濾，除去未完全消化的組織，之后1000 r/min離心2 min，棄上清液，加入Hanks液清洗組織，重復以上三個步驟3～5次，直至離心后上清中無雜物. 完全棄去上清，加入Histopaque1077約5 mL，充分混勻，移入15 mL離心管，然后小心加入Hanks液約5 mL，形成一個層面. 逐漸加速至2000 r/min離心20 min. 在Hanks液與Histopaque1077形成的層面上收集胰島. 用RPMI 1640 洗2遍后1000 r/min離心2 min即得到純化后的胰島〔2〕.

　　1.2.2胰島的鑒定

　　胰島用雙硫腙溶液鑒定〔3〕. 雙硫腙溶液配制如下：10 mg雙硫腙溶于3 mL無水乙醇中，加入3滴1 mmol/L氨水溶液，形成深紅色母液，用Hanks液1∶10稀釋,然后加入到收集純化胰島中，記數(shù)紅染細胞團.

　　1.2.3胰島素胰島孵育及胰島素分泌功能測定

　　將分離純化后的胰島放入預先加有RPIM1640培養(yǎng)液的24孔板，50個胰島/孔，加入外源性胰島素使其終濃度達100 μU/mL孵育胰島，分別孵育0， 60，120和240 min，(設(shè)0 min為對照組)然后用Hanks液(含3 mmol/L葡萄糖)洗滌2遍中止孵育. 每孔加入Hanks液定容1 mL，給予終濃度為16.7 mmol/L葡萄糖刺激(240 min組再給予終濃度為16.7 mmol/L葡萄糖加10 mmol/L精氨酸刺激)，分別在0，3，5，10和30 min吸取上清100 μL 作為待檢樣品，每個孵育組各重復8次，用放射免疫法測定胰島素分泌情況.

　　統(tǒng)計學處理： 計量資料用x±s表示，組間比較使用SPSS 11.0軟件進行方差分析及LSDt檢驗.

　　2結(jié)果

　　2.1胰島的形態(tài)及活性