摘要：構(gòu)建了原核表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-N，經(jīng)原核表達(dá)純化獲得小反芻獸疫病毒N蛋白。將純化的小反芻獸疫病毒N蛋白與對(duì)應(yīng)的酶標(biāo)二抗配對(duì)，通過(guò)對(duì)各個(gè)反應(yīng)條件的優(yōu)化建立了間接化學(xué)發(fā)光抗體檢測(cè)方法。通過(guò)對(duì)血清樣本的檢測(cè)，對(duì)該方法的敏感性、特異性、重復(fù)性、符合率進(jìn)行了評(píng)價(jià)。試驗(yàn)結(jié)果顯示：N蛋白最適包被濃度為0.5 μg/mL，最適包被條件為4℃ 24 h;酶標(biāo)二抗最適工作濃度為1∶2000。特異性試驗(yàn)證明，該方法與羊常見(jiàn)病毒的抗體陽(yáng)性血清沒(méi)有交叉反應(yīng)。通過(guò)檢測(cè)大量小反芻獸疫病毒抗體陰、陽(yáng)型血清，確定了科學(xué)的判定標(biāo)準(zhǔn)。

　　關(guān)鍵詞：原核表達(dá);最適條件;臨界值

　　推薦閱讀：《中國(guó)畜牧業(yè)》(半月刊)創(chuàng)刊于1992年，是由全國(guó)畜牧總站;中國(guó)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心;中國(guó)牧工商(集團(tuán))總公司主辦的刊物。

　　小反芻獸疫(Peste des Petits Ruminants，PPR)是由小反芻獸疫病毒(Peste des Petits Ruminants Virus，PPRV)引起的一種反芻動(dòng)物的烈性病毒性疾病。小反芻獸疫病毒具有高度傳染性，綿羊和山羊?yàn)橹饕腥緞?dòng)物，偶爾感染野生小反芻動(dòng)物，例如巖羊、野山羊等[1]。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)將其列為必須報(bào)告的動(dòng)物疫病，我國(guó)將其列為一類(lèi)動(dòng)物疫病。在《2018年國(guó)家動(dòng)物疫病強(qiáng)制免疫計(jì)劃》規(guī)定對(duì)全國(guó)所有羊進(jìn)行小反芻獸疫免疫。本試驗(yàn)利用原核表達(dá)的小反芻獸疫N蛋白作為包被抗原與其酶標(biāo)二抗配對(duì)，構(gòu)建了間接化學(xué)發(fā)光抗體檢測(cè)方法。

　　1 材料與方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 主要試劑

　　pET-28a原核表達(dá)載體、BL21感受態(tài)細(xì)胞由本公司實(shí)驗(yàn)室保存;法國(guó)ID-VET《小反芻獸疫抗體檢測(cè)試劑盒》購(gòu)于上海拜力生物科技有限公司;小反芻獸疫活疫苗(Clone9株)購(gòu)于新疆天康畜牧生物技術(shù)股份有限公司。

　　1.1.2 血清樣本

　　小反芻獸疫陽(yáng)性血清、小反芻獸疫陰性血清購(gòu)于中國(guó)獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心。500份已知來(lái)源的臨床羊血清由洛陽(yáng)萊普生信息科技有限公司提供，并經(jīng)法國(guó)ID-VET小反芻獸疫病毒阻斷ELISA抗體檢測(cè)試劑盒檢驗(yàn)證明。

　　1.2 方法

　　1.2.1 小反芻獸疫N蛋白的表達(dá)

　　小反芻獸疫病毒是單股負(fù)鏈RNA病毒，編碼8種已知蛋白，其中6種為結(jié)構(gòu)蛋白，分別為核衣殼蛋白(N)、磷蛋白(P)、基質(zhì)蛋白(M)、大蛋白(L)、血凝素蛋白(H)和融合蛋白(F)。大多數(shù)血清學(xué)檢測(cè)技術(shù)是針對(duì)小反芻獸疫病毒的核衣殼蛋白和血凝素蛋白而建立的[2]。大多數(shù)的單鏈RNA病毒，包括小反芻獸疫病毒在內(nèi)，N蛋白高度保守，免疫原性也較高。由于接近病毒基因組的3'末端，N蛋白的含量比其他結(jié)構(gòu)蛋白都要高。雖然針對(duì)N蛋白的抗體不能保護(hù)動(dòng)物免受該病侵害，但由于抗原性較好而且含量豐富，N蛋白仍然是小反芻獸疫診斷工具最易接受的目標(biāo)[3]。

　　從gene bank上查找小反芻獸疫N蛋白的基因序列號(hào)為AJ563705.1，并設(shè)計(jì)引物。上游引物序列為：5'-AATAGGATCCGCG CACGTGAACGACATGCTGA -3'，下游引物序列為：5'-CGGAAGCTTAATGTCGTAGAACTTGAGCGTGTG-3'。使用RNA提取試劑盒從小反芻獸疫疫苗中提取病毒核酸。并通過(guò)反轉(zhuǎn)錄PCR獲得cDNA，使用上述一對(duì)引物擴(kuò)增出小反芻獸疫N蛋白主要抗原表位區(qū)基因。將擴(kuò)增出來(lái)的目的基因、pET-28a空載體分別經(jīng)雙酶切之后與pET-28a載體連接。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。經(jīng)過(guò)條件篩選，確定合適的IPTG誘導(dǎo)濃度，培養(yǎng)溫度。經(jīng)表達(dá)純化獲得的小反芻獸疫N蛋白可作為試劑盒生產(chǎn)中的包被抗原使用。

　　1.2.2 包被緩沖液的選擇

　　分別選取25mM PBS(pH值7.4)、碳酸鹽緩沖液(pH值9.6)、50mM Tris-HCl(pH值8.0)作為包被緩沖液，包被濃度均為1 μg/mL。每孔100 μL，2～8℃放置24 h。用PBST洗板2次，每孔加入1.5% BSA，2～8℃封閉24 h。陽(yáng)性對(duì)照血清1/20稀釋之后加入到化學(xué)發(fā)光反應(yīng)板中，每孔加入100 μL，最后一行作為無(wú)血清對(duì)照。37℃反應(yīng)1 h，PBST洗滌5次，吸水紙上拍干之后，每孔加入100 μL工作濃度的羊抗豬酶標(biāo)二抗。37℃反應(yīng)1 h，PBST洗滌5次，吸水紙上拍干之后，每孔加入化學(xué)發(fā)光底物A液50 μL、化學(xué)發(fā)光底物B液50 μL。室溫、避光反應(yīng)5 min，使用化學(xué)發(fā)光免疫分析儀讀數(shù)。

　　1.2.3 包被條件的摸索

　　分別選取37℃ 3 h、4℃ 16 h、4℃ 24 h、三種包被條件進(jìn)行摸索。以1 μg/mL的蛋白濃度進(jìn)行包被，每孔加入100 μL。使用1.5% BSA封閉，陽(yáng)性對(duì)照血清1/20稀釋之后加入化學(xué)發(fā)光反應(yīng)板進(jìn)行反應(yīng)。選擇化學(xué)發(fā)光值高，并且變異系數(shù)最小的條件進(jìn)行包被。

　　1.2.4 封閉緩沖液的選擇

　　分別選取 1.5% BSA、1%酪蛋白、10%馬血清、3%明膠作為封閉液。封閉條件為2～8℃24 h。在化學(xué)發(fā)光反應(yīng)板上測(cè)定陽(yáng)性對(duì)照血清、陰性對(duì)照血清，計(jì)算二者化學(xué)發(fā)光值的比值(P/N)，根據(jù)比值大小確定最適封閉液。

　　1.2.5 血清稀釋倍數(shù)和抗原包被濃度的確定

　　使用棋盤(pán)滴定法來(lái)篩選最佳條件。使用包被緩沖液在化學(xué)發(fā)光包被板上按照濃度梯度進(jìn)行包被。選取陽(yáng)性對(duì)照血清、陰性對(duì)照血清進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)M(jìn)行測(cè)定。實(shí)驗(yàn)布局如表1所示。根據(jù)最終讀取的化學(xué)發(fā)光值計(jì)算陽(yáng)性對(duì)照血清、陰性對(duì)照血清二者的比值(P/N)，比值最大時(shí)為最適抗原包被濃度與血清稀釋倍數(shù)。

　　1.2.6 酶標(biāo)二抗最適濃度的篩選

　　使用不同濃度的酶標(biāo)二抗，對(duì)同一份強(qiáng)陽(yáng)性血清進(jìn)行測(cè)定。由于高濃度的酶標(biāo)二抗處于過(guò)量狀態(tài)，多余的二抗并不會(huì)結(jié)合到抗原-抗體復(fù)合物上。在酶標(biāo)二抗過(guò)量的濃度區(qū)間內(nèi)化學(xué)發(fā)光值下降緩慢，隨著酶標(biāo)二抗?jié)舛鹊闹饾u下降，化學(xué)發(fā)光值會(huì)呈現(xiàn)明顯下降趨勢(shì)。化學(xué)發(fā)光值明顯下降的拐點(diǎn)處所對(duì)應(yīng)的酶標(biāo)二抗?jié)舛燃词亲钸m工作濃度。

　　1.2.7 臨界值的確定

　　收集臨床血清樣本400份使用青島立見(jiàn)小反芻獸疫病毒阻斷ELISA抗體檢測(cè)試劑盒進(jìn)行測(cè)定，其中陽(yáng)性219份，陰性181份。使用建立好的實(shí)驗(yàn)體系，測(cè)定400份臨床血清樣本，實(shí)驗(yàn)結(jié)果按照S/P=樣本OD值/陽(yáng)性對(duì)照OD進(jìn)行計(jì)算。使用SPSS軟件對(duì)所有血清的S/P值與已知結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并繪制ROC曲線，取Youden指數(shù)最大時(shí)對(duì)應(yīng)的S/P值作為臨界值。

　　1.2.8 交叉實(shí)驗(yàn)

　　使用建立的實(shí)驗(yàn)體系，測(cè)定羊口蹄疫O型病毒陽(yáng)性血清、山羊痘病毒陽(yáng)性血清、綿羊痘病毒陽(yáng)性血清，同時(shí)設(shè)小反芻獸疫病毒陽(yáng)性血清作為對(duì)照。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果觀察化學(xué)發(fā)光方法的交叉反應(yīng)性。

　　2 結(jié)果與分析

　　2.1 重組蛋白表達(dá)及驗(yàn)證

　　2.1.1 pET-28a-N重組質(zhì)粒的構(gòu)建及驗(yàn)證

　　將擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，如圖1所示，在紫外燈下進(jìn)行觀察，目的條帶位置與已知的1578bp符合。

　　使用膠回收試劑盒將目的片段回收。將目的片段與pET-28a空載體進(jìn)行雙酶切，酶切之后將產(chǎn)物回收進(jìn)行連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細(xì)胞，固體培養(yǎng)基篩選得到單菌落，挑取單菌落使用液體培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，提取之后進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證，在1578bp附近有目的條帶出現(xiàn)。同時(shí)將構(gòu)建好的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，比對(duì)結(jié)果顯示沒(méi)有堿基錯(cuò)配。

　　2.1.2 pET-28a-N重組蛋白的表達(dá)及純化

　　將重組質(zhì)粒pET-28a-N轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行培養(yǎng)誘導(dǎo)表達(dá)，分別取誘導(dǎo)前菌液，誘導(dǎo)后菌液超聲波破碎的菌體沉淀和上清進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，結(jié)果如圖2所示。誘導(dǎo)后產(chǎn)物中有重組蛋白表達(dá)，分子量約為60kDa。大量誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)Ni-NTA樹(shù)脂親和層析純化后進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，得到分子量在80kDa左右的高純度蛋白，如圖2所示。

　　2.1.3 重組蛋白反應(yīng)性驗(yàn)證

　　純化之后目的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜結(jié)束之后使用小反芻獸疫標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清進(jìn)行孵育，然后加入鼠抗羊酶標(biāo)二抗進(jìn)行顯色。結(jié)果顯示：目的蛋白能夠與陽(yáng)性血清結(jié)合，在80kDa位置出現(xiàn)條帶，而空白對(duì)照泳道在該位置無(wú)條帶產(chǎn)生。結(jié)果如圖3所示。

　　M：蛋白Maker;1：空載體誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物;2：誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物;3：誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物上清;4：純化之后目的蛋白

　　M：蛋白Maker;1：目的蛋白與陽(yáng)性血清反應(yīng)結(jié)果;2：空白對(duì)照

　　2.2 包被緩沖液的選擇

　　分別使用三種包被緩沖液進(jìn)行包被，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示。其中CB包被時(shí)抗原吸附效率最高，并且P/N值最大，所以確定使用CB作為抗原包被緩沖液。

　　2.3 包被條件的確定

　　分別按照37℃ 3 h、4℃ 16 h、4℃ 24 h、三種包被條件進(jìn)行。選取一份弱陽(yáng)性樣本S1進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，根據(jù)發(fā)光值計(jì)算變異系數(shù)，變異系數(shù)最小的條件為最適條件。對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。發(fā)光值結(jié)果如表3所示，3種包被條件下發(fā)光值高度無(wú)明顯差異，但是4℃ 24 h條件下發(fā)光值變異系數(shù)最小，更有利于實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

　　2.4 封閉緩沖液的選擇

　　使用三種封閉緩沖液在2～8℃條件下封閉24 h。使用陽(yáng)性對(duì)照血清、陰性對(duì)照血清進(jìn)行測(cè)定，比較P/N值。結(jié)果顯示，10%馬血清作為封閉液時(shí)，陰性血清的本底值最低，且陽(yáng)性樣本與陰性樣本的區(qū)分程度最大。

　　2.5 抗原包被濃度及血清稀釋倍數(shù)的選擇

　　使用棋盤(pán)滴定法確定最佳的抗原包被濃度和血清稀釋度，實(shí)驗(yàn)布局如表1所示。將已經(jīng)確定為陰性和陽(yáng)性的血清梯度稀釋?zhuān)謩e加100 μL稀釋后的血清樣本到包被板，震蕩混勻，37°C孵育30 min;洗板5次，拍干。加入100 μL 酶結(jié)合物，震蕩混勻，37°C孵育30 min;洗板5次，拍干。加入50 μL發(fā)光底物液A和50 μL發(fā)光底物液B，震蕩混勻，室溫避光5 min，使用化學(xué)發(fā)光儀讀值，記錄結(jié)果。結(jié)果顯示，其中血清1∶40稀釋時(shí)陽(yáng)性血清信號(hào)值高度處于100000～150000之間，陰性血清發(fā)光值大于10000能夠保證整個(gè)實(shí)驗(yàn)體系的樣本值均處于化學(xué)發(fā)光儀精密性范圍之內(nèi)，在血清1∶40的條件里，抗原0.5 μg/mL包被時(shí)抗原用量最少，陰陽(yáng)區(qū)分明顯。所以，選擇抗原0.5 μg/mL包被，血清1∶40稀釋作為最適條件。結(jié)果見(jiàn)表5。

　　2.6 酶標(biāo)二抗最適工作濃度篩選

　　用優(yōu)化后的抗原包被濃度和血清稀釋度，將酶標(biāo)二抗做梯度稀釋。加100 μL血清樣本到包被板，震蕩混勻，37°C孵育30 min;洗板5次，拍干。加入100 μL 酶結(jié)合物，震蕩混勻，37°C孵育30 min;洗板5次，拍干。加入50 μL發(fā)光底物液液A和50 μL發(fā)光底物液B，震蕩混勻，室溫避光5 min，使用化學(xué)發(fā)光儀讀值，記錄結(jié)果，結(jié)果見(jiàn)表6。其中酶標(biāo)二抗?jié)舛葹?∶2000時(shí)，陽(yáng)性血清發(fā)光值在150000左右，陰性血清發(fā)光值大于10000，整個(gè)實(shí)驗(yàn)體系信號(hào)值高度處于化學(xué)發(fā)光儀精密性良好區(qū)間，且酶標(biāo)二抗1∶2000時(shí)，陰陽(yáng)樣本區(qū)分較大。

　　2.7 臨界值確定

　　用法國(guó)ID-VET抗體檢測(cè)試劑盒標(biāo)定血清500份，陽(yáng)性樣本289份，陰性樣本211份。使用建立的化學(xué)發(fā)光抗體檢測(cè)方法進(jìn)行測(cè)定。用ROC曲線來(lái)確定臨界值，敏感性代表陽(yáng)性檢出率，特異性代表因陰性檢出率;當(dāng)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)>0.39時(shí)，Youden指數(shù)最大為0.9479，所以確定S/P=0.4為臨界值，當(dāng)S/P≥0.4時(shí)，判定為陽(yáng)性;S/P<0.4時(shí)，判定為陰性。ROC曲線如圖3所示，陽(yáng)性符合率為100%，陰性符合率為94.8%。