摘要： 鹽芥是研究耐鹽機理的模式植物。為從蛋白質(zhì)水平揭示鹽芥響應(yīng)鹽脅迫的分子機制，本研究采用同位素標(biāo)記相對和絕對定量(iTRAQ) 技術(shù)對不同NaCl濃度處理7 d的鹽芥葉片進(jìn)行差異蛋白質(zhì)組學(xué)分析。結(jié)果表明，鹽芥葉片中共鑒定到4 607個蛋白質(zhì)，其中281個蛋白質(zhì)的表達(dá)豐度顯著增加，95個蛋白質(zhì)的表達(dá)豐度顯著降低。鹽脅迫差異表達(dá)蛋白質(zhì)的KEGG代謝通路和蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果表明，促進(jìn)植株光合作用可幫助鹽芥適應(yīng)低鹽環(huán)境;抑制葉綠素和支鏈氨基酸合成、調(diào)控應(yīng)激反應(yīng)基因的表達(dá)是鹽芥應(yīng)對中鹽環(huán)境的重要因素;而有效清除活性氧、提高滲透物質(zhì)積累量和增加能量供應(yīng)可能是鹽芥耐受高鹽環(huán)境的關(guān)鍵。本研究結(jié)果為揭示鹽芥應(yīng)答鹽脅迫的分子響應(yīng)機制提供了理論基礎(chǔ)。

　　關(guān)鍵詞： 鹽芥;鹽脅迫;差異蛋白質(zhì);iTRAQ

　　鹽脅迫是自然界中主要的非生物脅迫之一，土壤中的高濃度鹽分會使植物體內(nèi)離子失衡，產(chǎn)生滲透壓力，從而嚴(yán)重影響植物的生長和發(fā)育[1]。鹽芥是一年生草本植物，屬真鹽生植物，多生長于鹽漬化土壤中。鹽芥是擬南芥的近親[2-3]，同樣具有生長周期短、基因組構(gòu)成小(約為擬南芥的2倍)、種子數(shù)目多、可利用農(nóng)桿菌侵染花序法進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化試驗、遺傳轉(zhuǎn)化效率高等特點。因此，近幾年鹽芥被提出作為耐鹽分子機理研究的理想模式植物[2，4-5]。雖然鹽芥和擬南芥有很多相似的特性，但兩者之間的耐鹽性卻存在很大差異。通過轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分析擬南芥和鹽芥在響應(yīng)鹽脅迫的差異時，發(fā)現(xiàn)擬南芥中存在的鹽脅迫響應(yīng)基因，不管是否處于鹽脅迫環(huán)境，在鹽芥中均能高豐度表達(dá)[6-7]，說明鹽芥在面對逆境時是“有備無患”;而且鹽芥中存在特有的新陳代謝途徑，使得其在鹽脅迫條件下能減少由植物激素所誘導(dǎo)的生理修飾[8]，從而能在一定程度上承受更大的脅迫壓力。同時研究發(fā)現(xiàn)，鹽脅迫條件下，鹽芥根系的磷酸化蛋白質(zhì)組發(fā)生改變，這些變化的磷酸化蛋白質(zhì)參與了信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、活性氧清除、能量途徑、蛋白質(zhì)合成以及蛋白質(zhì)折疊等過程[9]，這些研究為將來從磷酸化水平上研究鹽芥的耐鹽機制提供了重要的理論依據(jù)。

　　目前，人們已從鹽芥中鑒定到一些與鹽脅迫耐受相關(guān)的基因和調(diào)控因子，如編碼K+/Na+轉(zhuǎn)運蛋白基因(ThHKT1)[10-11]、編碼細(xì)胞質(zhì)膜和液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因(ThNHX1)和(ThSOS1)[12-14]、焦磷酸酶基因(TsVP) [15-17]、高親和性K+轉(zhuǎn)運體(ThHAK5)[18]、脯氨酸合成基因(ThP5CS)[19]、Cu/Zn超氧化物歧化酶基因(ThCSD)[20]等，且部分基因的生物學(xué)功能已得到一定的闡述。我們前期對鹽芥葉片和葉綠體響應(yīng)鹽脅迫的比較蛋白質(zhì)組學(xué)的研究結(jié)果表明，鹽芥可通過Na+液泡區(qū)隔化，積累滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)(如淀粉、可溶性糖、脯氨酸等)，以及維持光合效率和生長發(fā)育等方式來適應(yīng)鹽脅迫環(huán)境[21-22]。本研究在已有的研究基礎(chǔ)上，應(yīng)用先進(jìn)的同位素相對標(biāo)記與絕對定量技術(shù)(iTRAQ)對不同鹽濃度處理條件下的鹽芥葉片進(jìn)行比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究，并重點分析不同鹽濃度處理對鹽芥葉片蛋白質(zhì)表達(dá)豐度的影響，期望揭示鹽芥適應(yīng)不同鹽濃度條件的蛋白質(zhì)化學(xué)機制，為揭示鹽芥耐鹽分子機制提供參考。

　　1 材料與方法

　　1.1 試驗材料與試驗設(shè)計

　　將鹽芥種子直接點播在基質(zhì)土(營養(yǎng)土∶蛭石=1∶1，體積比)中，放置在培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)條件：溫度為白天22 ℃，晚上20 ℃;相對濕度為60%±5%;16 h光照，8 h黑暗。種子發(fā)芽后，用1/2濃度Hoagland營養(yǎng)液每3 d澆灌1次。2個月后，挑選長勢一致的鹽芥植株用含有0 mmol/L、200 mmol/L(低鹽)、400 mmol/L(中鹽)和600 mmol/L(高鹽)NaCl的1/2濃度Hoagland營養(yǎng)液進(jìn)行澆灌，每天更換新的營養(yǎng)液，每個鹽濃度處理36株植株。收集連續(xù)澆灌7 d(根據(jù)前期的預(yù)試驗確定的鹽處理時間)的鹽芥葉片，每12株為1個生物學(xué)重復(fù)，液氮速凍，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

　　1.2 鹽芥葉片蛋白質(zhì)的提取、酶解及iTRAQ分析

　　參照Wang等[23]的BPP法提取鹽芥葉片總蛋白質(zhì)，用預(yù)冷的甲醇和丙酮清洗蛋白質(zhì)沉淀，然后溶解在蛋白質(zhì)裂解液(7 mol/L尿素，2 mol/L硫脲，4% CHAPS(一種非變性的兩性離子型去垢劑)，30 mmol/L Tris-HCl，pH 8.5)中。以牛血清白蛋白(BSA)為標(biāo)準(zhǔn)溶液，通過Bradford測定法測定蛋白質(zhì)濃度[24]。取100 μg用不同濃度的NaCl處理的鹽芥葉片總蛋白質(zhì)，用胰蛋白酶進(jìn)行消化后，使用iTRAQ試劑分別標(biāo)記0 mmol/L、200 mmol/L、400 mmol/L和 600 mmol/L NaCl處理的上述葉片總蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)物后，再進(jìn)行等量混合。采用強陽離子變換(SCX)色譜柱(4.6 mm×250.0 mm， Aqua C18， 5 μm， 100 )對iTRAQ標(biāo)記的肽段進(jìn)行預(yù)分級，再通過液相串聯(lián)質(zhì)譜對標(biāo)記肽進(jìn)行鑒定，獲取差異表達(dá)肽段信息。

　　1.3 質(zhì)譜數(shù)據(jù)搜庫

　　使用Proteinpilot軟件(Version 4.5)對質(zhì)譜結(jié)果進(jìn)行搜庫，搜索數(shù)據(jù)庫為自建的鹽芥蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，蛋白數(shù)據(jù)從美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)網(wǎng)站(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/12266)上下載。搜庫參數(shù)設(shè)置為：酶類為Trypsin，錯誤剪切位點數(shù)為1，固定修飾位點為Carbamidomethyl(C)，可變修飾位點為Oxidation(M)。將0 mmol/L NaCl處理鹽芥葉片蛋白質(zhì)作為對照組，200 mmol/L NaCl、400 mmol/L NaCl、600 mmol/L NaCl作為處理組，按處理組與對照組離子的峰面積比值，選擇置信度在95%以上的結(jié)果進(jìn)行報告。質(zhì)譜鑒定出的可信蛋白質(zhì)篩選參數(shù)應(yīng)滿足：可信度在95%以上的肽置信水平，至少鑒定出2條肽段，且錯誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)≤1%。

　　1.4 質(zhì)譜數(shù)據(jù)生物信息學(xué)分析

　　通過KEGG途徑分析對可信鑒定的蛋白質(zhì)參與的代謝通路進(jìn)行富集。同時，對鹽脅迫差異表達(dá)蛋白質(zhì)(變化倍數(shù)>1.50或<0.67，P<0.05)進(jìn)行KEGG代謝途徑和蛋白質(zhì)間相互作用網(wǎng)絡(luò)分析(https：//string-db.org/cgi/input.pl)。

　　1.5 部分鹽脅迫差異表達(dá)蛋白質(zhì)對應(yīng)基因的qRT-PCR分析

　　提取用不同鹽濃度處理的鹽芥葉片總RNA，取1 μg總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，并將反轉(zhuǎn)錄后的cDNA樣品稀釋5倍后用于qRT-PCR分析，每個樣品至少重復(fù)3次qRT-PCR試驗。取1 μl稀釋后的cDNA加入到SYBR Green PCR Master mix體系中，使用Mx3005P熒光定量PCR儀進(jìn)行qRT-PCR試驗，鹽芥的actin基因(NCBI基因登錄號312283264)作為內(nèi)參基因。用于qRT-PCR的引物序列詳見表1。

　　2 結(jié)果與分析

　　2.1 鹽芥葉片蛋白質(zhì)種類分析及鹽脅迫差異表達(dá)蛋白質(zhì)的篩選

　　應(yīng)用iTRAQ技術(shù)結(jié)合AB5600+高端生物質(zhì)譜儀對鹽芥葉片總蛋白質(zhì)進(jìn)行定量分析，3次iTRAQ重復(fù)鑒定出的可信蛋白質(zhì)數(shù)分別為3 750個、3 897個和3 901個，共計4 607個蛋白質(zhì)至少在1次重復(fù)中鑒定到的可信的鹽芥葉片總蛋白質(zhì)，其中3 811個蛋白質(zhì)至少在2次重復(fù)試驗中得到可信鑒定(圖1A)。這3 811個可信蛋白質(zhì)參與了18條代謝途徑，其中碳水化合物代謝途徑參與的蛋白質(zhì)種類最多(988個蛋白質(zhì))，其次是翻譯類蛋白質(zhì)(895個蛋白質(zhì))與折疊、分類和降解類蛋白質(zhì)(830個蛋白質(zhì))、氨基酸代謝(579個蛋白質(zhì))、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(547個蛋白質(zhì))、運輸和分解代謝(522個蛋白質(zhì))、脂質(zhì)代謝(496個蛋白質(zhì))、環(huán)境適應(yīng)(452種蛋白質(zhì))、能量代謝(416種蛋白質(zhì))等代謝途徑類蛋白質(zhì)(圖1B)。

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