摘要：采用單因素變量和不同激素組合設(shè)計(jì)，觀察不同激素配比對(duì)甘草(Glycurrihiza uralensis Fisch.)帶芽莖段誘導(dǎo)叢生芽的影響。結(jié)果表明，誘導(dǎo)叢生芽的最佳激素組合為 MS+0.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L KT，其叢生芽的平均增值倍數(shù)達(dá)到(5.00±1.61)倍。適宜的激素配比有利于甘草帶芽莖段誘導(dǎo)叢生芽，為甘草快速繁殖技術(shù)的應(yīng)用提供理論和技術(shù)依據(jù)。

　　關(guān)鍵詞：甘草(Glycurrihiza uralensis Fisch.);帶芽莖段;叢生芽;激素

　　Abstract: Single factor variable and different hormone combination design were used to observe the effect of different hormone ratio on the induction of clustered buds from the bud stem of Glycyrrhiza uralensis Fisch. The results showed that the best hormone combinatior for inducing cluster buds was MS+0.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L KT, and the average multiplication factor of cluster buds reached 5 times Appropriate hormone ratio is beneficial to the induction of clustered buds from the budded stems of Glycyrrhiza uralensis Fisch, and provides theoretical and technical basis for the application of rapid propagation technology of Glycyrrhiza uralensis Fisch.

　　Key words: Glycurrihiza uralensis Fisch. ; budded stems; cluster buds; hormone

　　甘草(Glycurrihiza uralensis Fisch.)為豆科甘草屬多年生草本植物[1]，是最常用的藥用植物資源之一，其根莖入藥，具多種藥理活性，有廣泛的藥用和商業(yè)價(jià)值[2]。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)對(duì)甘草的需求日益增加，甘草野生資源面臨過(guò)度開(kāi)采和枯竭的威脅[3]，質(zhì)量和產(chǎn)量急劇下降，種質(zhì)資源遭到嚴(yán)重破壞。隨著科技的不斷發(fā)展和應(yīng)用，利用甘草組培技術(shù)進(jìn)行快繁已有大量研究。汪連海等[4]采用不同激素配比的培養(yǎng)基，以甘草無(wú)菌苗莖尖為材料進(jìn)行快繁研究，成功優(yōu)化出增殖培養(yǎng)基 ，建立甘草快繁體系，甘草組織培養(yǎng)技術(shù)不僅有利于繁殖、增殖和保存，而且有利于誘導(dǎo)次級(jí)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生[5]，為甘草有效成分的提取奠定基礎(chǔ)。而利用帶芽莖段誘導(dǎo)叢生芽具有穩(wěn)定的遺傳性[6]，魏曉雪等[7]對(duì)野生興安百里香進(jìn)行快繁研究，證明帶芽莖段為興安百里香組培的最佳外植體，因此本試驗(yàn)采用甘草無(wú)菌苗的帶芽莖段為材料，將無(wú)菌苗帶芽莖段接種在不同激素含量的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)叢生芽，通過(guò)測(cè)量植株株高、莖節(jié)段數(shù)、真葉片數(shù)及叢生芽的增值倍數(shù)等，以確定最佳的培養(yǎng)條件，研究最佳的植物激素濃度組合，確定甘草帶芽莖段誘導(dǎo)叢生芽最佳培養(yǎng)基配方，以期為甘草快繁技術(shù)的應(yīng)用提供理論指導(dǎo)及技術(shù)支撐。

　　1材料與方法1.1 材料

　　經(jīng)專家鑒定為當(dāng)年生甘草的無(wú)菌苗帶芽莖段。

　　1.2方法

　　本試驗(yàn)于2019年4月于齊齊哈爾大學(xué)生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院植物代謝生理研究室進(jìn)行。

　　1.2.1 處理方法 在無(wú)菌條件下，選擇正常生長(zhǎng)20d、茁壯、有節(jié)段的無(wú)菌苗，在超凈工作臺(tái)上用滅菌鑷子取出，置于事先經(jīng)高壓滅菌干燥冷卻后的濾

　　紙上，用滅菌解剖刀和鑷子取其帶芽莖段0.7cm，放人不同激素處理的培養(yǎng)基內(nèi)，每瓶接種4個(gè)帶芽莖

　　段，封口后放入恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，溫度為25℃，光照2000 1x。

　　1.2.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)培養(yǎng)基中6-BA，KT和NAA的濃度比進(jìn)行單因素和組合因素設(shè)計(jì)相應(yīng)適合叢生芽誘導(dǎo)的培養(yǎng)基。培養(yǎng)基中均加入30g/.蔗糖、8g/.，單因素設(shè)計(jì)：0M5+6-BA(0.2.0.6.1.0，1.41.8.2.2)mg/L;2MS+KT(0.2.0.6，1.0.1.4，1.8，2.2)mg/L;組合因素設(shè)計(jì)如表1和表2所示，每組設(shè)置3個(gè)平行試驗(yàn)，每瓶25 ml.培養(yǎng)基。

　　1.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 接種 20 d后觀察帶芽莖段誘導(dǎo)叢生芽及愈傷組織生長(zhǎng)情況，按照下列方法計(jì)算叢生芽增值倍數(shù)和愈傷組織誘導(dǎo)率。

　　叢生芽增值倍數(shù)=分化出叢生芽個(gè)數(shù)接種帶芽莖段數(shù)量;愈傷組織誘導(dǎo)率=(形成的愈傷組織塊數(shù)/

　　接種外植體數(shù))×100%。

　　2結(jié)果與分析

　　2.1 6-BA對(duì)帶芽莖段叢生芽誘導(dǎo)的影響2.1.1 不同濃度6-BA對(duì)帶芽莖段生長(zhǎng)的影響由表3可知，6-BA濃度為0.2和1.4 mg/L.時(shí)均沒(méi)有叢生芽產(chǎn)生;MS+1.8 mg/L.6-BA對(duì)帶芽莖段株高影響最大，為(10.4010.26)cm，與其他濃度存在極顯著差異;MS+ 1.8 mg/l.6-BA的帶芽莖段節(jié)段、節(jié)間距、真葉數(shù)分別為(5.67+1.15)節(jié)、(1.660.15)cm、(6.67土

　　1.15)片，表明6-BA濃度為1.8 mg/L.對(duì)甘草壯苗最為有利。

　　2.1.2 不同濃度6-BA對(duì)甘草帶芽莖段叢生芽形成的影響 由表4可知，MS+0.2 mg/L.6-BA沒(méi)有叢生芽產(chǎn)生;6-BA濃度為0.6 mg/L時(shí)，其叢生芽的增值倍數(shù)為2.67+0.53;MS+2.2 mg/L.6-BA叢生芽增值倍數(shù)為3.0010.20，且每個(gè)叢生芽均有1-2片真葉，6-

　　BA濃度在1.0-2.2 mg/L，隨6-BA濃度的升高，甘草叢生芽的增值倍數(shù)升高。

　　2.1.3 不同濃度6-BA對(duì)帶芽莖段愈傷組織形成的影響 不同濃度的 6-BA 對(duì)甘草帶芽莖段誘導(dǎo)愈傷

　　組織生長(zhǎng)發(fā)育有一定影響，由表 5 可知，6-BA 濃度在 0.2和 0.6 mg/L 的培養(yǎng)基中，愈傷組織的生長(zhǎng)狀態(tài)良好且褐化率分別為 11.11% 和 33.33%，6-BA 濃度在 1.0~2.2 mg/L 褐 化 率 依 次 為 33.33%、66.67%、44.44%、55.56%;隨 6-BA 濃度的升高，愈傷組織有褐化趨勢(shì);但 6-BA 濃度在 0.2~2.2 mg/L 出愈率均達(dá)到 100%。

　　2.2 不同濃度KT對(duì)甘草帶芽莖段叢生芽誘導(dǎo)的影響

　　如表 6 所示，在本試驗(yàn)所設(shè)的 6 個(gè) KT 濃度下(0.2~2.2 mg/L)甘草帶芽莖段均沒(méi)有長(zhǎng)叢生芽，但卻有根和愈傷組織生成。表明不同濃度的 KT 對(duì)甘草帶芽莖段生長(zhǎng)發(fā)育影響較大，KT 為 2.2 mg/L 時(shí)甘草帶芽莖段植株高度達(dá)(9.30±1.35)cm，與其他濃度存在極顯著差異;而且莖節(jié)數(shù)可達(dá)(4.75±0.71)個(gè)，與KT 1.4 和 1.0 mg/L 存在極顯著差異，和其他濃度之間沒(méi)有顯著差異;MS+2.2 mg/L KT 真葉為(5.25± 1.04)片，與 KT 1.0 mg/L 存在極顯著差異，與其他濃度沒(méi)有顯著差異，說(shuō)明 KT不利于誘導(dǎo)叢生芽。

　　2.3不同6-BA+KT組合對(duì)帶芽莖段叢生芽誘導(dǎo)的影響

　　2.3.1 不同6-BA+KT組合對(duì)帶芽莖段生長(zhǎng)的影響不同濃度的6-BA+KT對(duì)甘草帶芽莖段生長(zhǎng)發(fā)育的影響見(jiàn)表7，0.3 mg/L.6-BA+0.2 mg/.KT對(duì)帶芽莖段株高影響最大，株高可達(dá)(8.63+1.21)cm，莖節(jié)數(shù)也可達(dá)(4.67±0.58)個(gè)/株，同時(shí)，該組合還對(duì)提高真葉片數(shù)最為有利。但就促進(jìn)節(jié)間伸長(zhǎng)而言，0.4 mg/L.6-

　　BA+0.6 mg/.KT的影響最大，可達(dá)為(1.90±0.23)cm。對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)而言，0.9 mg/L 6-BA+0.6 mg/L.KT最為有利，愈傷半徑高達(dá)(0.37±0.13)cm，因此綜合來(lái)看，0.3 mg/L.6-BA +0.2 mg/.KT對(duì)甘草壯苗有利。

　　2.3.2 不同6-BA+KT組合對(duì)甘草帶芽莖段叢生芽形成的影響 由表8可見(jiàn)，不同6-BA和KT配比對(duì)甘草帶芽莖段誘導(dǎo)叢生芽生長(zhǎng)發(fā)育具有一定影響，0.4 mg/l.6-BA +0.6 mg/L.KT對(duì)叢生芽增值倍數(shù)誘導(dǎo)最高，為(2.00r0.00)倍，與0.8 mg/.6-BA+1.2mg/.KT存在顯著差異，與其他濃度無(wú)差異;對(duì)叢生芽高度誘導(dǎo)，為(2.78+0.37)cm;叢生芽節(jié)間距為(1.50±0.27)cm;誘導(dǎo)叢生芽真葉為(1.33±0.13)片，與其他濃度均無(wú)差異;說(shuō)明 0.4 mg/L 6-BA+0.6 mg/L KT 為誘導(dǎo)叢生芽的增值倍數(shù)較適合的濃度。

　　2.3.3 不同 6-BA+KT 組合對(duì)帶芽莖段愈傷組織形

　　成的影響 由表 9 所示，不同濃度 6-BA+KT 對(duì)甘草帶芽莖段愈傷組織形成具有顯著影響，在 6-BA+KT的 5個(gè)組合中，雖然均能誘導(dǎo)出愈傷組織，但長(zhǎng)勢(shì)都不理想，愈傷組織大多都褐化趨于黑色，當(dāng)帶芽莖段接種到 6-BA+KT 組合培養(yǎng)基中，6 d 左右?guī)а壳o段底端膨大，出現(xiàn)水樣化，愈傷組織有生長(zhǎng)跡象，在13 d 左右莖段底部有淡黃色水樣化愈傷組織，連續(xù)培養(yǎng) 16 d左右愈傷偏淺褐色，最后褐化甚至變黑色。

　　2.4不同激素組合對(duì)甘草叢生芽增值倍數(shù)的影響

　　由表10可知，不同濃度的6-BA，KT和NAA及其組合對(duì)甘草帶芽莖段誘導(dǎo)叢生芽有影響且存在一定差異，綜合上述試驗(yàn)，適合甘草帶芽莖段叢生芽誘導(dǎo)的平均增值倍數(shù)(>3)的激素組合為MS+2.2 mg/L6-BA，MS+0.4 mg/L.6-BA+0.6 mg/L.KT，MS+0.5 mg/L.6-BA +0.5 mg/L.KT+0.1 mg/L.NAA，MS+0.5 mg/L.6-BA+0.5 mg/L.KT，其中MS+0.5 mg/L.6-BA+0.5 mg/L.KT叢生芽的平均增值倍數(shù)達(dá)到(5.00±1.61)倍。

　　3 討論

　　試驗(yàn)把甘草帶芽莖段分別接種在不同激素組合的培養(yǎng)基中，在誘導(dǎo)培養(yǎng)階段發(fā)現(xiàn)，僅添加 6-BA 的培養(yǎng)基誘導(dǎo)率較高，適宜的 6-BA 濃度可顯著促進(jìn)叢生芽的形成，此結(jié)果與王效宇[8]在隨 6-BA 濃度的升高，甘草叢生芽的增值倍數(shù)升高的結(jié)論一致。高濃度的 6-BA 對(duì)芽生長(zhǎng)有抑制作用，與王非等[9]在 6-BA濃度對(duì)褐毛鐵線蓮帶芽莖段誘導(dǎo)叢生芽中，適宜的 6-BA 濃度促進(jìn)褐毛鐵線蓮帶芽莖段叢生芽的形成，高濃度對(duì)叢生芽生長(zhǎng)有抑制作用的結(jié)果相一致。在僅添加KT的培養(yǎng)基中沒(méi)有叢生芽的產(chǎn)生，但對(duì)帶芽莖段的生長(zhǎng)發(fā)育有顯著影響。本試驗(yàn)在6BA和KT組合中發(fā)現(xiàn)，隨著KT濃度的逐漸升高，從生芽增值倍數(shù)有下降趨勢(shì)，與梁昊[0)在KT濃度升高對(duì)干層塔叢生苗生長(zhǎng)有抑制影響，且較高濃度均會(huì)對(duì)叢生苗的生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用，甚至死亡的結(jié)論一致。在只有6-BA的培養(yǎng)基中愈傷有褐化情況，而當(dāng)加入KT之后，隨著濃度的增加愈傷組織不僅均趨于褐化而且出現(xiàn)黑色愈傷。進(jìn)一步說(shuō)明在6-BA與KT組合時(shí)，同時(shí)增加6-BA和KT的濃度對(duì)愈傷組織體積的狀態(tài)沒(méi)有很大的改變，但對(duì)愈傷組織的生長(zhǎng)狀況有抑制的趨勢(shì)[1)

　　大量研究表明，適宜的生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素組合可有效誘導(dǎo)植物外植體分化與生長(zhǎng)，于紅梅等[2]

　　在以海沃德獼猴桃?guī)а壳o段為外植體直接誘導(dǎo)叢生芽，建立快繁體系中發(fā)現(xiàn)，不同配比生長(zhǎng)素與細(xì)胞分裂素對(duì)叢生芽誘導(dǎo)影響顯著。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)不同激素組合對(duì)甘草帶芽莖段誘導(dǎo)叢生芽生長(zhǎng)有不同程度的影響，在甘草外植體誘導(dǎo)分化叢生芽的生長(zhǎng)周期內(nèi)，帶芽莖段誘導(dǎo)叢生芽?jī)?yōu)化培養(yǎng)的適宜培養(yǎng)基是MS+0.5 mg/L.6-BA+0.5 mg/L.KT，莖段能否進(jìn)行芽增值受到多種因素的影響，叢生芽增殖率高低很大程度上取決于一定范圍內(nèi)細(xì)胞分裂素與生長(zhǎng)素的配比[13]，細(xì)胞分裂素水平增高，增進(jìn)芽發(fā)育，易形成叢生芽。因此，在叢生芽的誘導(dǎo)過(guò)程中，細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素的配比是非常重要的[14]。

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