摘要對水芹類胡蘿卜素粗提物的分離純化條件進行了研究，獲得最優分離純化條件為：選用孔徑100目~200目硅膠C，填充柱徑高比為1：4，上樣量2ml，洗脫劑與填充劑皆為丙酮與石油醚混合溶液(體積比1：20)，此時提取物類胡蘿卜素含量為3.39ug/ml，純化倍數為1.53，另外，試驗還證實了水芹類胡蘿卜素對羥自由基、DPPH.自由基、超氧負離子皆具有一定的體外清除能力，這為水芹類胡蘿卜素開發應

　　用提供了依據。

　　關鍵詞 水芹;類胡蘿卜素;分離純化;抗氧化研究

　　Abstract The separation and purification conditions of the crude extract of carotenoids were studied by single facto experiment，including the type of filler，the amount of sample，the ratio of column to diameter and the ratio of eluent to the optimal separation and purification conditions.The optimal separation and purification conditions were as follows Silica gel G with a pore size of 100-200 mesh.a column diameter ratio of 1：4.2 mL loading.and the same conditions as the filling solvent are acetone：petroleum ether.The volume ratio is 1：20 mixed solution.Under the optimal conditions of separation and purification，the isolated carotenoid content was up to 3.39 ug/ml and the purification ratio was 1.53.The experiment confirmed that the cress carotenoid substance has certain scavenging ability to hydroxvl radical.DPPH free radical and superoxide anion.

　　Keywords water celery;carotenoid;separation and purification;anti-oxidation

　　類胡蘿卜素作為一種重要的生理活性物質，在食品、醫藥和保健品等方面具有廣闊的應用前景。 類胡蘿卜素種類繁多，廣泛存在于水果蔬菜中。水 芹是人們經常食用的水生蔬菜，含有芹菜素、黃 酮、氨基酸、類胡蘿卜素等功能成分，在其功能成分含量以及活性判定等方面仍具有很大的研究空 間。本試驗旨在探究水芹類胡蘿卜素粗提物分離純 化的最優條件，并對其進行抗氧化活性判定，以期 為水芹及其類胡蘿卜素的開發利用提供依據。

　　1 材料與方法

　　1.1 主要材料與試劑

　　水芹，購自南京農貿市場，經預處理和榨汁、有機溶劑提取，制得粗提物，供進一步分離純化。 丙酮、石油醚、水楊酸、Tris、抗壞血酸、二 苯代苦味肼基 (DPPH)、鄰苯三酚 (焦性沒食子 酸) 等，均為分析純;硅膠，100 目 ~200 目、200目 ~300 目，青島海洋化工廠產品;β- 胡蘿卜素標 準品，上海麥克林生化科技有限公司。

　　1.2 主要儀器

　　電熱恒溫鼓風干燥箱，上海精宏實驗設備有限 公司;KH-100B 型超聲波清洗器，昆山禾創超聲儀器有限公司;754N 紫外可見分光光度計，上海儀 電分析儀器有限公司;TGL-16G 離心機，上海安亭

　　科學儀器廠;旋轉蒸發儀，上海亞榮生化儀器廠; 全波長酶標儀 Mutiskan GO，奧豪斯儀器 (上海) 有限公司。

　　1.3 β- 胡蘿卜素含量的測定 稱取適量 β- 胡蘿卜素標準品，用丙酮溶解定 容于 10 mL 棕色容量瓶中，得到系列質量濃度的標準品溶液。利用紫外分光光度計測定各質量濃度標準品在 450 nm 最大吸收波長處的吸光度值，根據質量濃度與吸光度值的對應關系繪制標準曲線 (圖1)，線性方程為 y=0.098 8x+0.004 8，R2=0.999 1。 在線性方程的輔助下計算樣品中 β- 胡蘿卜素含量。

　　1.4 柱層析分離純化

　　將填充用的硅膠 G (100 目 ~200 目、200 目 ~300 目) 于 110 ℃烘箱中烘干 1 h 活化備用。稱取 適量的硅膠 G，用丙酮與石油醚比例為 1:20 的混合溶液溶解，進行濕法填柱，填柱過程中用吸耳球輕 輕敲打柱身，柱子不能出現氣泡以及裂縫，并保持 填充劑上表面平整。沿管壁環形從柱頂慢慢加樣，洗脫劑同樣使用丙酮與石油醚比例為 1∶20 的混合溶液進行洗脫，整個過程保證填充劑始終浸在洗脫劑中，不能使洗脫劑流干。維持適當的流速，對分離的黃色組分進行收集并鑒定成分。

　　1.5 類胡蘿卜素結構鑒定

　　1.5.1 薄層色譜層析 取活化后鋪好的薄層板，在離底邊約 1 cm~2 cm處用鉛筆畫一條基線，在基線上用毛細管分別點上β- 胡蘿卜素標準品和分離純化后的水芹類胡蘿卜素樣品。因樣品濃度較低可以適當多點幾次，每次點完要晾干后再繼續點樣，以避免點樣直徑過大。將點好樣的薄層板置于層析缸中在暗處展開，展開劑選用體積比為 2∶1 的石油醚 - 丙酮混合液。在 自然光下觀察樣品與標準品的展開狀況。

　　1.5.2 紫外 - 可見光吸收光譜

　　利用酶標儀在 200 nm~500 nm 區域內對分離純 化后的樣品進行波長掃描，得到水芹類胡蘿卜素分 離純化產物的紫外 - 可見光吸收光譜。

　　1.6 抗氧化活性測定

　　1.6.1 水楊酸法羥自由基清除率的測定依參考文獻[4][5]進行，略有調整，按下式計 算：

　　1.6.2 DPPH·自由基清除率的測定

　　1.6.3 超氧負離子自由基清除率的測定

　　2 結果與分析

　　2.1 水芹類胡蘿卜素粗提物的分離純化

　　2.1.1 洗脫劑對分離純化的影響

　　采用洗脫劑和裝柱溶劑一致的條件 (采用常規方法，預試驗用乙醇填充硅膠并不能很好的出現分離條帶，因此選用一致的洗脫劑和裝柱溶劑)，進 行丙酮與石油醚 1∶10、1∶20、1∶30 的試驗，發現以 1∶10 的溶劑比為洗脫條件，不能出現黃色條 帶即不能分離出目標產物;1∶20、1∶30 的分離效 果好，出現綠色和黃色條帶且分離程度好，分離時 間短。

　　2.1.2 填充物對分離純化的影響

　　硅膠的分離效果比氧化鋁的分離效果好，氧化鋁分離速度慢，色素條帶不清晰，需要高濃度的色素溶液上樣才能出現清晰的條帶。對硅膠的孔徑大小(100目-200目、200目-300目)進行比較試驗，發現200目-300目硅膠做填充物時由于孔徑較大，樣品組分在柱中停留時間長，分離效率不高;而100目-200目孔徑硅膠做填充物時能夠以相對較快的速率完成組分分離。因此，100目-200目孔徑硅膠填充物分層效果更好。

　　2.1.3柱徑高比對分離純化的影響在對柱徑高比的試驗研究中，發現柱徑高比為1：3時色素條帶分離程度不夠，與柱徑高比為1：4.

　　1：5的分離柱相比柱長略短;柱徑高比1：5時，葉綠素與類胡蘿卜素的黃色與綠色條帶分離明顯，但是由于柱長過長，分離時間長，相比而言柱徑高比為1：4時分離效果最好。

　　2.1.4 上樣量對分離純化的影響在對上樣量的試驗研究中，采用1 ml，2ml.

　　3mlL的梯度進行試驗，發現經過柱層析分離后的類胡蘿卜素成分含量相差不大。1 mL上樣量顏色較淺，對比度不高;2mL.上樣量適中，能夠有效的進行分層判定;3mL上樣量分層清晰，顏色明顯。但由于分離后含量相差不大，說明上樣量為3mlL時，組分在柱子中與填充物結合較多，得到的產物量相對較少，而上樣量為1 mL時，顏色區分不明顯不能滿足操作要求，因此上樣量2mL時分離效果最好。

　　2.1.5 最優分離純化條件的確定

　　綜合上述試驗結果，最優分離純化條件組合初步確定如下：選用孔徑100目-200目硅膠G，填充柱徑高比1：4，上樣量2mL，洗脫劑與填充劑皆為丙酮：石油體積比1：20，此時提取物類胡蘿卜素含量均值可達3.39 ug/mL，純化倍數為4.255 8/2.783 8=1.53，其中2.783 8，4.255 8 為樣品在分離純化前、后的B-類胡蘿卜素含量。

　　2.2水芹類胡蘿卜素結構的鑒定

　　22.1 薄層色譜層析結果

　　展開劑選擇石油醚與丙酮體積比為2：1的混合溶劑，極性較低。由于水芹色素中的類胡蘿卜素極性低，而葉綠素的極性高，根據相似相溶原理，類胡蘿卜素在該展開劑中會被很快推到薄層板的前端。由于點樣的樣品是經過柱層析分離后的類胡蘿卜素溶液，因此葉綠素的含量更少，在板中未出現多個斑點，只有黃色的 β- 胡蘿卜素的斑點。在水 芹色素粗提物中由于葉綠素含量多，β- 胡蘿卜素 為占比較小的組分，因此先經分離純化再進行薄層色譜層析，排除葉綠素的干擾。同時也可檢測柱層 析是否起到良好的分離效果。

　　由圖 2 可見，水芹類胡蘿卜素斑點與 β- 類胡蘿卜素標準溶液同行展開，比移值時刻保持相同， 因此可定性分離純化后的水芹類胡蘿卜素溶液為 β- 胡蘿卜素。

　　2.2.2 紫外 - 可見光吸收光譜圖

　　水芹類胡蘿卜素溶液與丙酮的紫外可見光吸收光譜，見圖 3。

　　由圖3可知，兩條譜線在200 mm~300 mm之間大部分重合，因為樣品溶解于丙酮中，排除溶液對樣品吸收光譜的干擾;在440 mm-460 mm處水芹類胡蘿卜素溶液的吸收峰明顯高于丙酮。參考B-胡蘿卜素的特征吸收峰，可判斷水芹類胡蘿卜素溶液中的主要成分是B-胡蘿卜素。

　　2.3抗氧化活性的測定

　　2.3.1 水楊酸法羥自由基清除率的測定不同質量濃度水芹類胡蘿卜素V，對羥自由基清除率如下頁圖4所示。從圖4可看出，水芹類胡蘿卜素質量濃度與羥自由基清除率總體上呈正相關，即 β- 胡蘿卜素質量濃度越高其羥自由基清除 率就越高。但通過與抗壞血酸對比，在相同質量濃 度時，抗壞血酸的自由基清除率高于水芹 β- 胡蘿卜素。在較高質量濃度時，水芹 β- 胡蘿卜素也具 有較高的自由基清除率，這為水芹的進一步開發利用提供了依據。

　　2.3.2 DPPH·自由基清除率的測定

　　DPPH·自由基的清除率可反應水芹 β- 胡蘿卜素的抗氧化能力，根據公式計算，得到水芹 β- 胡蘿卜素樣品的清除率可達 9.42%，說明在 β- 胡蘿卜素這種自由基清除劑存在下，DPPH·的孤對電子與其配對顏色降低，證明水芹 β- 胡蘿卜素具有較 好的抗氧化活性。

　　2.3.3 超氧負離子清除率的測定

　　不同質量濃度水芹類胡蘿卜素對超氧負離子的 清除率見圖 5。

　　由圖5水芹類胡蘿卜素對超氧負離子的清除率的關系可得出，隨著B-胡蘿卜素質量濃度的增加，其對超氧負離子的清除率也逐漸增加，且清除率在40%水平以上。這表明水芹對超氧負離子具有很強的清除作用。

　　3結論

　　試驗結果表明，采用柱層析技術對水芹類胡蘿卜素粗提物進行分離純化是可行的，當硅膠G孔徑大小為100目-200目，填充物柱徑高比為1：4，上樣量2ml，洗脫劑與填充劑皆為丙酮石油醚混合液(體積比1：20)，此時物質分層顏色對比清晰，分離效果較佳，純化倍數可達153對分離純化液進行薄層色譜層析以及紫外可見光吸收光譜檢測，確定水芹中類胡蘿卜素主要是B-胡蘿卜素。同時3種體外抗氧化活性試驗皆表明水芹類胡蘿卜素對不同自由基有不同清除能力，其中對超氧負離子清除效果最好，這為水芹類胡蘿卜素的開發利用提供了依據。

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文章名稱： 水芹類胡蘿卜素粗提物的分離純化、結構鑒定及抗氧化活性研究

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