摘要：將導(dǎo)入苦瓜DNA私稻新品種(D9)胚乳淀粉的顆粒形態(tài)、粒徑分布、結(jié)晶結(jié)構(gòu)、糊化、凝膠質(zhì)構(gòu)和分子組成等特性與受體進(jìn)行了比較。結(jié)果表明，D9淀粉3pm以下的體積百分比明顯增加，而9um以上的大顆粒體積百分比減少。D9淀粉的分子有序化指標(biāo)值分別為0.67和1.66，明顯高于受體的0.60和1.18，但差示掃描量熱分析起糊溫度為65.5 ℃，顯著低于受體的77.8℃.D9淀粉的最高黏度、最低黏度、崩解值和終黏度分別為2683.0，1074.0，1 609.0，1 499.5mPa.s，均顯著高于受體淀粉，而回生值(425.5 mPa-s)低于受體的463.5 mPa.s，D9淀粉的膨脹勢(shì)和凝膠彈性值分別為20.01 g/g和2.69mm，顯著高于受體淀粉的，而直鏈淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)、最大吸收波長(zhǎng)和碘藍(lán)值分別為3.33%.561.0 nm和0.16，均顯著低于受體淀粉的。導(dǎo)入苦瓜DNA引起了粘稻胚乳淀粉的粒徑組成、分子組成和結(jié)構(gòu)的顯著變化。

　　關(guān)鍵詞：苦瓜功能稻;淀粉;理化特性;分子組成

　　Abstract：The particle morphology，particle size distribution，crystal structure，gelatinization，gel texture and molecule properties of indica rice starch of importing bitter melon DNA(D9)were compared with its receptor.The results showed that the volume percentage of D9 starch <3 m increased significantly, while the volume percentage of large granule >9 pm decreased.The molecular ordering index values of D9 starch were 0.67 and 1.66 respectively, which were significantly higher than those of receptor, 0.60 and 1.18; while the pasting temperature of differential scanning calorimetry was 65.5 ℃, which was significantly lower than that of receptor 77.8 ℃.The hig hest viscosity，the minimum viscosity，disintegration value and final viscosity of D9starch were 2 683.0，1 074.0，1 609.0，1 499.5 mPa•s，respectively，which were significantly higher than those of receptor starch.However，the retrogradation value(425.5 mPa s)lessthan 463.5 mPa.s of the receptor starch.The swelling power and gel elasticity of D9 starch were 20.01 g/g and 2.69 mm respectively，significantly higher than the receptor starch However，the amylose content，the maximum absorption wave length and the iodine blue value were 13.33%，561.0 nm and 0.16 respectively，significantly lower than that of the receptor starch.Importing the bitter melon DNA into rice caused of rice endosperm starch was caused the significant variations in granule size composition，molecular composition and structure of the endosperm starch.

　　Keywords：bitter melon function rice;starch;physicochemical properties;molecular composition

　　隨著健康產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，普通食品功能化和功能食品主食化成為一個(gè)重要趨勢(shì)[1]，作為重要主食的水稻育種戰(zhàn)略也隨時(shí)代的發(fā)展而變化，功能稻作為育種的一個(gè)重要方向，近年取得了豐碩的成果，如高直鏈淀粉[2]、高y-氨基丁酸(GABA)[5]、抗高血壓[1]、抗氧化6-0、抗過(guò)敏[]、巨胚[6]等水稻品種相繼問世。課題組前期采用花粉管通道法將苦瓜DNA導(dǎo)入秈稻，獲得農(nóng)藝性穩(wěn)定遺傳的子代(2017年農(nóng)業(yè)部審定，品種名：早優(yōu)517)，并證明苦瓜DNA片斷成功整合進(jìn)子代DNA中，且生理活性的主要目標(biāo)物質(zhì)皂苷等成分在胚乳中顯著表達(dá)，但關(guān)于苦瓜DNA的導(dǎo)入對(duì)水稻品質(zhì)的影響尚未明確，尤其是苦瓜DNA的導(dǎo)入對(duì)水稻淀粉精細(xì)結(jié)構(gòu)的影響還需進(jìn)一步研究。研究擬針對(duì)導(dǎo)入苦瓜基因的功能稻早優(yōu)517(9)，系統(tǒng)分析D9和受體(RT)胚乳淀粉的顆粒形態(tài)、粒徑分布、結(jié)晶結(jié)構(gòu)、糊化、凝膠質(zhì)構(gòu)和分子組成等特性，以期為中國(guó)功能稻的加工及應(yīng)用提供參考。

　　1材料與方法

　　1.1 試驗(yàn)材料

　　1.1.1 稻谷樣品

　　苦瓜功能稻早優(yōu)517成熟稻谷(試驗(yàn)編號(hào)D9，2018年、湖南)和受體成熟稻谷(試驗(yàn)編號(hào)RT，2018年、湖南)：湖南省水稻研究所何登驥研究員提供。稻谷樣品種植在4片相連的水田，總面積約0.67 hm"，其中一片種植RT，其他3片田種植D9，每片田的稻谷分別收獲，分別隨機(jī)取稻谷樣品約10 kg，曬干至適當(dāng)含水量后，分別采用蓉谷機(jī)去殼的糙米作為試驗(yàn)材料。

　　1.1.2 主要試劑

　　鹽酸、硫酸：優(yōu)級(jí)純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;氫氧化鈉、乙醇、正戊醇、乙醚、二甲基亞砜

　　(DMSO)、碘化鉀：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

　　1.1.3 主要儀器

　　掃描電子顯微鏡(SEM)：S-4800型，日本Hitachi公司;激光粒度分析儀：LS-POP(6)型，珠海歐美克儀器有限公司;x射線衍射儀：D8 Advance型，德國(guó)Bruker公司;傅里葉紅外光譜分析儀(FTIR)：Nexus 470型，美國(guó)梅特勤公司;

　　差示掃描量熱計(jì)(DSC)：Q2000型，美國(guó)TA公司;

　　快速黏度分析儀(RVA)：Super4型，澳大利亞Newport Scientific公司;質(zhì)構(gòu)分析儀：CT3型，美國(guó)Brookfield公司;蓉谷機(jī)：FC2K-Y型，株式會(huì)社山本制作所。

　　1.2 試驗(yàn)方法

　　1.2.1 淀粉樣品制備 稻米胚乳淀粉的樣本制備采用實(shí)驗(yàn)室常用的藏一醇提取法。稱取樣品200 g，在4℃水浸泡24 h后，經(jīng)磨漿過(guò)篩(120目)，離心(5 000× g，5 min，4 ℃)收集濕淀粉。加濕淀粉體積的4倍氫氧化鈉溶液(0.1 mg/100 mL.)，4℃下攪拌2h以上，離心(5 000× g，5 min，4 ℃)收集濕淀粉，此處理重復(fù)3次后用0.1 mol/L的HCI溶液調(diào)節(jié)pH值至中性。濕淀粉在4倍體積去離子水中充分分散，加入正戊醇100 mL，激烈攪拌2h以上，然后靜止12 h以上，除去醇層，重復(fù)此步驟至醇液層透明為止。過(guò)400目篩后，離心(5 000 ×g，5 min.4 ℃)收集濕淀粉。用G4砂芯過(guò)濾器充分抽濾，依次加適量無(wú)水乙醇3次、乙醚3次進(jìn)行洗滌，充分抽干淀粉后，于40 ℃下?lián)]發(fā)殘余乙醚。作為顆粒淀粉樣品在干燥器中保存?zhèn)溆谩?/p>

　　取上述顆粒淀粉樣品約1 g，加10 ml.DMSO，待充分糊化后加入95%乙醇50 ml，勻后離心(5 000xg.10 min)收集淀粉。此步驟重復(fù)2次。然后在G4砂芯過(guò)濾器上抽濾收集淀粉，并依次加入適量無(wú)水乙醇3次、乙醚3次進(jìn)行洗滌，充分抽干后，于40 ℃下?lián)]發(fā)殘余乙醚。

　　作為高純度脫脂淀粉樣品在干燥器中保存?zhèn)溆谩?/p>

　　1.2.2 SEM觀察 采用Bhat等[0]的方法處理樣本后，采用掃描電子顯微鏡進(jìn)行觀察。

　　1.2.3 粒度分析 參照陶湘林等[1])的方法，采用激光粒度分析儀進(jìn)行分析，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次。

　　1.2.4 結(jié)晶結(jié)構(gòu)分析 參照Mir等[2]的方法，采用粉末x射線衍射儀進(jìn)行分析，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次。

　　1.2.5 FTIR分析 根據(jù)滿建民等[1]的方法，采用傅里葉紅外光譜分析儀進(jìn)行分析，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次。

　　1.2.6 DSC分析 參照陶湘林等[1])的方法，采用差示掃描量熱計(jì)進(jìn)行分析，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次。

　　1.2.7 RVA分析 參照Z(yǔ)hu等[W]的方法，采用快速黏度分析儀分析，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次。

　　1.2.8 膨脹勢(shì)測(cè)定 根據(jù)Tang等03的方法測(cè)定淀粉膨脹勢(shì)，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次。

　　1.2.9 凝膠質(zhì)構(gòu)分析 針對(duì)上述膨脹勢(shì)測(cè)定用獲得的淀粉凝膠，采用質(zhì)構(gòu)分析儀進(jìn)行質(zhì)構(gòu)分析，選用直徑2mm圓柱形不銹鋼探頭TA10，采用TPA分析模式，探頭壓縮速度為0.5 mm/s，壓縮距離為3mm，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定10次。

　　1.2.10 淀粉一碘溶液可見光譜分析 根據(jù)李林靜等[1]的方法測(cè)定，并基于680 nm碘藍(lán)值計(jì)算淀粉的表觀直鏈淀粉含量，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次。

　　1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

　　所有數(shù)據(jù)均采用Excel 2010和Origin 2018軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析處理。

　　2結(jié)果與分析

　　2.1 淀粉顆粒的形態(tài)與大小

　　D9和RT淀粉顆粒形態(tài)與大小，在SEM的觀察中(圖1)未見明顯的差異，均是典型的水稻淀粉形態(tài)。兩者的淀粉顆粒均為表面光滑的不規(guī)則多面體，平均大小約為5um。通過(guò)激光粒度儀分析，淀粉顆粒的體積分布圖譜幾乎是重疊在一起(圖2)，對(duì)數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)(表1)，D9和RT的平均粒徑均為5.5pm，3~9um的中顆粒體積百分比分別為93.2%和92.3%，D9和RT無(wú)顯著差異。但D9和RT在3pm以下小顆粒體積百分比分別為2.7%和2.4%，而9um以上的大顆粒體積百分比分別為4.2%和5.3%，D9和RT有顯著差異。

　　說(shuō)明苦瓜DNA的導(dǎo)人可一定程度地干預(yù)秈稻淀粉顆粒形態(tài)的相關(guān)基因表達(dá)，導(dǎo)致淀粉顆粒的粒徑組成發(fā)生變化。

　　2.2 淀粉顆粒的分子有序性

　　淀粉顆粒的廣角X射線衍射圖譜如圖3所示，主峰的位置主要分布在13~25，在160~19有特征偶極峰，在20左右觀察到源于直鏈淀粉一脂肪的單螺旋結(jié)構(gòu)形成的小峰，D9和RT均屬典型的谷物類A型結(jié)晶淀粉[句]。淀粉的結(jié)晶區(qū)是由支鏈淀粉的雙螺旋結(jié)構(gòu)規(guī)則排列形成[17]，D9淀粉的相對(duì)結(jié)晶度為37.75%，RT的相對(duì)結(jié)晶度為36.14%，統(tǒng)計(jì)上有顯著差異(表2)。

　　D9與RT淀粉的傅里葉變換紅外光譜如圖4所示，主要差異表現(xiàn)在1050~950 cm-1波數(shù)區(qū)間，參照滿建民等[2]的方法，測(cè)量波數(shù)1 045，1 022，995 cm-1各峰頂點(diǎn)至基線的高度(峰強(qiáng)度)，計(jì)算出1045 cm-1/1 022 cm-1和1022 cm-1/995 cm-1的峰強(qiáng)度比值(表2)，D9淀粉分別為0.67和1.66，RT淀粉分別為0.60和1.18，D9與RT之間均有顯著差異，表明D9淀粉顆粒的分子有序化程度更高[2]，與相對(duì)結(jié)晶度的結(jié)果一致。

　　說(shuō)明苦瓜DNA的導(dǎo)人不僅對(duì) 米淀粉顆粒形態(tài)的

　　基因表達(dá)有一定程度的干預(yù)，同時(shí)對(duì)淀粉顆粒組織結(jié)構(gòu)的形成機(jī)制產(chǎn)生實(shí)質(zhì)影響。

　　2.3 淀粉顆粒的糊化特性

　　DSC圖譜顯示(圖5)，D9和RT淀粉的結(jié)晶結(jié)構(gòu)融解，分子完全變?yōu)闊o(wú)序狀態(tài)的溫度區(qū)間存在顯著性差異。

　　RVA圖譜也表現(xiàn)了顯著不同(圖6)，DSC和RVA分析的數(shù)據(jù)列于表3.DSC分析的起糊溫度、峰溫度和終結(jié)溫度，D9分別為65.5，71.3，78.2 ℃，糊化溫度范圍12.7℃;RT分別為77.8，81.8，86.7℃，糊化溫度范圍9.8 ℃，但D9的糊化熔值為10.1 J/g，顯著高于RT的8.5 J/g.

　　RVA分析，D9到達(dá)最高黏度的時(shí)間為4.4 min，比RT快0.6 min，獲得的糊化溫度分別為74.7，82.4℃，與DSC的分析結(jié)果一致。另外，D9的最高黏度、最低黏度、崩解值和黏度分別為2683.0.1 074.0，1 609.0，1 499.50 mPa.s，顯著高于RT的各指標(biāo)值。但D9的回生值為425.5 mPa.s，顯著低于RT的463.5mPa.s。從溫度的視角，D9淀粉較易糊化，但較難老化。從分子秩序和糊化特性的所有指標(biāo)值推斷，D9淀粉的支鏈分子含量較高，分子量較大，分支較多而鏈長(zhǎng)較短[4.1-13]，雖然形成的結(jié)晶區(qū)相對(duì)較大，但結(jié)晶結(jié)構(gòu)強(qiáng)度較低,致使熱穩(wěn)定性較差。同時(shí)可能與 D9淀粉 小顆粒相對(duì)較多,大顆粒相對(duì)較少也有一定關(guān)系[17,19]。 從上述分子秩序和糊化特性的結(jié)果可推斷,D9稻米 煮熟性較好且米飯老化較慢,作為口糧用的加工品質(zhì)等 得到一定程度提升。

　　2.4 淀粉的凝膠特性淀粉的凝膠特性

　　如表4所示。D9的膨脹勢(shì)為20.01g/g,顯著高于 RT的18.62g/g。D9凝膠質(zhì)構(gòu)指標(biāo) 的硬度、黏性、彈性和咀嚼性等均高于 RT,而內(nèi)聚力和黏 著性等均低于 RT。這些結(jié)果支持 D9淀粉的支鏈分子含 量較高,分子量較大,分支較多而鏈長(zhǎng)較短的推斷[19]。但 除彈性指標(biāo)外,D9和 RT 的各單項(xiàng)指標(biāo)之間統(tǒng)計(jì)上無(wú)顯 著性差異,可能是質(zhì)構(gòu)測(cè)量樣品平行數(shù)量較少,同時(shí)使用 的測(cè)量探頭直徑太小,獲得的數(shù)據(jù)少而偏差值太大所致, 在今后的測(cè)量中應(yīng)改進(jìn)。

　　結(jié)果表明D9稻米因蒸煮熟化后的彈性增加，與原受體稻米比較，口感品質(zhì)可能更偏向梗稻米的質(zhì)感。

　　2.5 淀粉的分子及組成特性

　　淀粉分子與碘分子可形成包含復(fù)合物，使溶液呈藍(lán)色.D9和RT吸收光譜存在顯著差異(圖7)，在550~

　　800 nm范圍內(nèi)D9的吸光度均低于RT.如表5所示，最大吸收波長(zhǎng)(Amax)，D9為561 nm，RT為581 nm。波長(zhǎng)680 nm值(BVao an)，D9為0.16，RT為0.20，基于BVsam計(jì)算的表觀直鏈淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)，D9為13.33%，顯低于RT的16.47%

　　這些結(jié)果表明，D9不僅直鏈淀粉含量較低，且支鏈分子的鏈長(zhǎng)較短1.1]?？喙螪NA的導(dǎo)入引起了受體的淀粉生物合成機(jī)制變化，D9淀粉的品質(zhì)提升主要是基于淀粉分子水平的變化。

　　3結(jié)論

　　研究將導(dǎo)入苦瓜DNA水稻品種(早優(yōu)517)胚乳淀粉的顆粒形態(tài)、粒徑分布、結(jié)晶結(jié)構(gòu)、糊化、凝膠質(zhì)構(gòu)和分子組成等特性與受體進(jìn)行了比較。優(yōu)517淀粉顆粒組織的分子秩序較高，表現(xiàn)了較大的最高黏度、最低黏度、崩解值、終黏度、膨脹勢(shì)和凝膠彈性值，而熱穩(wěn)定性、凝膠回生值等指標(biāo)較小。這些理化特性的差異，是源于較小的直鏈淀粉含量、最大吸收波長(zhǎng)和碘藍(lán)值等指標(biāo)。導(dǎo)入苦瓜DNA引起了淀粉分子組成和結(jié)構(gòu)的顯著變化。推斷：早優(yōu)517作為口糧用米的場(chǎng)合，食味品質(zhì)優(yōu)于受體。遠(yuǎn)緣植物DNA導(dǎo)人，可使秈稻獲得植物生理活性成分的顯著表達(dá)，同時(shí)對(duì)稻米淀粉的生物合成機(jī)制產(chǎn)生實(shí)質(zhì)性改變，這些改變包含有利于食味品質(zhì)改善的良性機(jī)制。但期望進(jìn)一步打破各研究領(lǐng)域間的無(wú)形壁壘，健全多領(lǐng)域合作攻關(guān)機(jī)制，廣泛共享育種科研人員掌握的育種資源，加快淀粉分子結(jié)構(gòu)與理化性質(zhì)之間的數(shù)量關(guān)系，以及淀粉生物合成機(jī)制的研究進(jìn)展。

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文章名稱： 苦瓜功能稻米的淀粉理化特性分析

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