摘要 據調查發現海南島柑橘根部寄生線蟲危害嚴重，其根部主要寄生線蟲為腎形線蟲(Rordlenchulus spp.)，且分布廣泛，侵染根部對其造成嚴重影響。從海南島柑橘園中采集表現為黃化、小葉等癥狀的發病植株根部土樣，用改良貝曼漏斗法分離土壤線蟲，通過形態學觀察與測量、28S rDNA D2-D3區序列擴增、測序、比對及進行系統發育分析。結果表明，在60份土樣中該線蟲檢出率為66.7%，蟲口密度最高達513條/100 mL土：由形態學鑒定為腎形線蟲。對腎形線蟲28S rDNA D2-D3區PCR擴增條帶大小為780 bp左右，與目標基因大小一致。測序結果與GenBank中登錄的數據進行Blast比對，與腎狀腎形線蟲(Rorylenchulus renijormis)數據同源性高達99%以上。根據比對結果構建系統發育樹，結果與已報道的腎狀腎形線蟲聚為一類。結合形態學與分子生物學技術，將該線蟲鑒定為腎狀腎形線蟲。本研究對柑橘根部土壤腎形線蟲的調查和鑒定研究，為該病害的診斷和防治提供理論參考。

　　關鍵詞 柑橘，腎狀腎形線蟲(Rotylenchulus reniformis)，鑒定

　　Abstract According to the survey, the parasitic nematodes in the citrus roots of Hainan Island were seriously endangered. The main parasitic nematodes in the roots were Rotylenchulus spp. which were widely distributed inHainan Island. The nematodes parasite plants roots and made a severe influence on them. Root soil samples were collected from the diseased plants showing yellowing and lobular of the citrus orchards in Hainan island, and the soil nematodes were isolated by modified Beman funnel method. Morphological observation and measurement, 28SrDNA D2-D3 region amplification and sequencing were performed, then alignment and phylogenetic analysis were conducted. The results showed that the detection rate of the nematode was 66.7% in 60 soil samples, andthe highest population density was 513/100 mL soil; it was identified by morphology as Rotylenchulus spp. The size of the PCR amplification band of the 28S rDNA D2-D3 region of the Rotrlenchulus spp. was about 780 bp, which was consistent with the target gene size. The sequencing results were compared with the data registered in GenBank for Blast, and the homology with the Rotylenchulus reniformis was over 99%. The phylogenetic tree was constructed based on the alignment results, and the results were clustered with the reported nephrons. The nematode was identified as Rotrlenchulus reniformis in combination with morphology and molecular biology techniques. This paper investigated and identified Rotilenchulus spp. in the citrus roots, providing a theoretical reference for the diagnosis and prevention of the disease

　　Keywords Citrus. Rotylenchulus reniformis, Identification

　　柑橘(Citrus reticulata Blanco.)是世界第一大水果，目前中國有19個省(市，區)大規模種植，是世界最大的生產國。海南島種植的柑橘類果樹中以瓊中“綠橙”和澄邁“福橙”最為知名，已成為當地農民脫貧致富的主導產業之一，對農業增效和農民增收起著至關重要的作用。其中，瓊中“綠橙”和澄邁“福橙”前身均為廣東紅江橙(Citrus tangerine Hot.et TanakaxCitrus sinensis(L.)Osbeck)，綠橙于20世紀80年代初引入瓊中縣，而福橙也已于2002年引入澄邁縣。柑橘線蟲病是造成產量損失和品質下降的主要病原之一(向旭等，2009)。近年來，隨著種植面積擴大和栽培年限增加，出現了可能因寄生線蟲為害而誘發的植株衰退現象。有研究表明，腎形線蟲屬(Rotylenchulus spp.)廣泛分布于地中海、熱帶與亞熱帶地區，已有11個物種被報道(Palomares-Rius et al，2018)。在中國，腎形線蟲病在香蕉園發病普遍，且對香蕉危害嚴重

　　(周峽等，2012)。在美國東南部，腎形線蟲造成棉花減產通常為1%~5%，2015年估計損失24.211x10kg，價值約為3600萬美元(Ruijuan et al，2018)腎形線蟲以雌蟲侵染植物根系，在取食過程導致根部膨脹類似于腎臟(Wubben et al.，2015);被害植株常表現根系皮層組織脫落，甚至壞死或腐爛，地上部表現為植株矮小、葉片黃化，產量降低，嚴重者整株死亡(Robinson et al.，1997)，28s DNA D2-D3區是不同植物寄生線蟲基因組保守的區域，在其種類鑒定中有很多應用(王會芳等，2015)，本研究對海南島柑橘主要產區腎形線蟲病發生危害情況進行調查，并利用形態學和28S r DNA D2-D3序列分析進行病原鑒定，以期為該病害的準確診斷和高效防治提供依據。

　　1結果與分析

　　1.1發生與為害

　　在被調查的海南島2個縣12個柑橘園中，發現其中8個被腎形線蟲侵染為害，果園受害率為66.67%。綠橙園中的線蟲種群密度比福橙園中的大(表1)，砂質土果園中線蟲種群密度比黏質土果園中的大，表明砂質土有利于腎形線蟲的發生和侵染。8個柑橘園中，線蟲種群密度最大為513條100 mL土

　　(瓊中縣彎嶺排營坡村)，最小為28條100mL土(澄邁縣紅光農場團結隊)。

　　1.2形態特征

　　未成熟雌蟲(RRLC1種群)：加熱殺死后蟲體呈"C"形，唇區隆起、前端圓，呈梨形，無縊縮，唇架骨硬化(圖la)：口針長12.6-16.9um，基部球圓形，高3.4-4.1 um，2.5-3.2 pm，食道腺長，口針基部球距食道腺開口距離與口針長度約相等;中食道球及瓣門清楚，中食道球長近圓形;排泄孔位于食道峽基部(圖1b)，最大體寬14，7-17.4 um。陰門橫裂，雙生殖腺對生(圖10)：尾部長25.3-34.1 um，呈長圓錐形，透明尾端長4.2-9.4 um(圖1d)。

　　雄蟲(RRLC1種群)：食道、口針和食道腺模糊，中食道球不明顯，無明顯瓣膜(圖1e;圖1h);交合刺伸出體外長16.7-21.1 pum，交合傘退化(圖1g)，未完全包蓋尾端(圖1c)。

　　根據形態特征觀察和測量值(表2)，初步將其鑒定為腎狀腎形線蟲(Rotylenchulus renjormi)，與張燕等(2011)報道的一致。

　　1.3分子生物學鑒定及同源性分析

　　對8個線蟲種群28S rDNA D2-D3區進行擴增，由PCR擴增電泳圖，結果顯示，其片段長度均在780 bp左右(圖2)，RRLC1和RRFC8種群克隆后的測序結果為786 bp，與腎狀腎形線蟲序列長度一致。

　　從8個腎形線蟲種群中選出2個種群進行測序。將288 rDNA D2-D3區測序結果與Gen Bank中登錄的數據進行Blast比對。結果表明，在同源性已明確的100個種群中，RRLC1和RRFC8種群與海南香蕉種群HM131858.1、浙江種群KPO 54126.1和廣東木瓜種群HM131883.1相一致，其與腎狀腎形線蟲的同源性最高，均達到99.62%以上。

　　將測序的2個腎狀腎形線蟲種群與Gen Bank中公布的腎形線蟲屬中其它種群種類和相近的屬同時進行分析，基于28S rDNA D2-D3區序列，利用MEGA 7.0軟件采用鄰接法構建基于28S rDNAD2-D3區序列的柑橘腎形線蟲RRLC1和RRFC8種群的系統進化樹(圖3)，結果表明，RRLCI和RRFC8種群與NCBI中登陸的腎狀腎形線蟲聚為一類。且其與國內外已報道的腎狀腎形線蟲的親緣關系較近：與Rotylenchus conicaudatus Rotylenchus brevicaudatus和Rotylenchulus macrosoma等的親緣關系較遠。RRLC1和RRFC8種群與孢囊線蟲屬(Heterodera spp.)、螺旋線蟲屬(Helicotylenchus spp.)、仙人掌皮線蟲屬(Cactodera spp.)、球孢囊屬(Globodera spp.)等的親緣關系較遠。

　　結合以上形態學觀察、形態測量值和分子生物學鑒定及同源性分析結果，將來自于海南澄邁和瓊

　　中的柑橘腎形線蟲RRLC1和RRFC8種群最終鑒定為腎狀腎形線蟲(Rotylenchulus reniformi)

　　2討論

　　本研究對采集于海南島柑橘類果樹8個種植區柑橘園的腎狀腎形線蟲的未成熟雄蟲和雄蟲形態特征進行了觀察，發現不同腎狀腎形線蟲種群間的形態測量值存在差異。本研究測量值比張燕等(2011)報道的福建種群偏大，而在張紹升和章淑玲(2005)報道的福建種群的體長范圍之內。通過對其中2個種群(RRLC1和RRFC8)的28 rDNA D2-D3序列與和Gen Bank數據庫中序列比對分析，發現其與登錄號HM-131858.1，KP054126.1和HM131883.1的相似度達99%以上。國內外已報道R.reniformi種群的同源性存在極小地域差異。

　　腎狀腎形線蟲作為重要的植物病原，可導致植物發育遲緩，抑制根系生長和降低產量。但是田間癥狀表現不明顯，難以在視覺上評估線蟲造成的損害(Rujuan et al.，2018)。據報道(Robinson，2007)，美國中南部地區棉花上腎狀腎形線蟲已經取代了根結線蟲(Meloidogyne spp.)而成為主要病原線蟲。相對于根結線蟲和孢囊線蟲，腎形線蟲研究較少。高小倩(2012)對福建柑橘線蟲病病原進行了鑒定，發現腎狀腎形線蟲是影響柑橘生長的重要線蟲種類之一。腎狀腎形線蟲侵染為害后地上部的癥狀與植株缺水缺 素相似，因此被不易察覺，對海南島柑橘產業的發展 存在潛在威脅，應引起足夠重視。

　　3 材料與方法

　　3.1 樣本采集和分離 采用 5 點取樣法，于 2018 年 5~10 月分別從海南 島 12 個柑橘園中采集柑橘根系及根際周圍 5~20 cm深的土壤，將樣品裝入封口袋并做好標記，實驗室內 用改良貝曼漏斗法分離土壤中的線蟲。

　　3.2 形態學鑒定

　　挑取未成熟雌蟲和雄蟲各20 條線蟲制作臨時玻 片，在光學顯微鏡下進行形態學觀察和顯微計測。對線蟲的體長(Body length)、最大體寬(Maxmun body width)、口針長(Stylet length)、口針基部球高(Stylet knob height)、口針基部球寬(Stylet knob width)、背食道腺開口至口針基部球距離(DGO)、尾長(Tail)、交合 刺長(Spicule length)等主要形態學特征進行測量。

　　3.3 分子鑒定

　　采用林伯榮等(2017, 中國農業科學技術出版社,pp.1-3)方法提取單條線蟲的DNA。使用通用引物 D2：5'-ACAAGTACCGTGAGGGAAAGTTG-3';引物 D3：5'-TCGGAAGGAACCAGCTACTA-3'，引物由上海 生工合成。擴增程序條件：初始變性溫度為 94℃，時 間 3 min，變性溫度為 94℃，時間 60 s，退火溫度為55℃，時間 90 s，延伸溫度為 72℃，時間 1 min，共 34個 循環，再 72℃延伸 5 min。將擴增產物克隆到 T 載體(PMD-18Tvector, TaKaRa, 日本)，轉化 DH5α 菌株; 挑取陽性克隆子送至上海生工生物工程技術服務有限公司測序。將測序結果整理拼接后，登錄 GenBank 獲得相應登錄號。通過 DNAMAN 7.0 軟件對 28SrDNA D2-D3 區序列進行相似性分析。用 MEGA7.0軟件將所得序列通過鄰接法(neighbor-joining)構建系統發育樹。

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文章名稱： 海南島柑橘腎形線蟲病的發生及病原鑒定

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