【摘要】目的 觀察小柴胡湯對人肝星狀細胞(LX-2細胞)增殖的影響。方法 體外培養LX-2細胞，用不同濃度的小柴胡湯(2%.1%，0.5%，0.2%，0.1%)處理24 h，對照組不做處理。顯微鏡下觀察藥物作用后細胞形態改變，采用四甲基偶氮唑鹽(MTT)法和5-乙炔基-2脫氧尿嘧啶核苷(Edu)法檢測細胞增殖，實時熒光定量PCR(RT-PCR)檢測1型膠原(COL-I)mRNA的表達情況。結果 對照組細胞，貼壁生長良好，形態未見明顯異常。經不同濃度小柴胡湯(2%、1%、0.5%，0.2%，0.1%)處理24 h后，LX-2細胞均出現皺縮，變圓，界限不清，細胞核固縮等不同程度形態改變，MTT檢測顯示其增殖抑制率分別為100%，54.9%、41.2%、14.8%、12.4%。經1%、0.5%、0.1%小柴胡湯作用24 h后，Edu法檢測LX-2細胞增殖率分別為0.1%，5.3%，10.1%;RT-PCR檢測其COL-I mRNA的表達量，與對照組1.04±0.35相比，均顯著下降，分別為0.45±0.15(P<0.05)、0.27±0.16(P<0.01)和0.38±0.24(P<0.01)，MTT和Edu結果表明小柴胡湯能夠抑制體外培養L.X-2細胞的增殖，并呈劑量依賴效應。結論 小柴胡湯通過抑制LX-2細胞增殖，并抑制COL-I mRNA的表達，從而發揮抗纖維化活性。

　　【關鍵詞】小柴胡湯;血吸蟲病;肝纖維化;LX-2細胞;細胞增殖

　　[ Abstract Obiectives To observe the effects of a Xiaochaihu decoction (XCH) on the proliferation of human hepaticstellate cells (LX-2). Methods LX-2 cells were cultured and treated with different concentrations of XCH (2%, 1%,0.5%, 0.2%, and 0.1 %) in vitro for 24 h. The control group was not treated. Changes in cell morphology were observed under a microscope. Methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) and 5-ethynyl-2deoxyuridine (Edu) were used to evaluate LX-2cell proliferation. RT-PCR was used to evaluate expression of type I collagen (COL-I) mRNA in cultured cells. ResultsIn the control group, the cells grew well and had no obvious abnormalities. After treatment with different concentrations of XCH (2%. 1%. 0.5%. 0.2%, and 0.1 %) , LX-2 cells displayed various morphological changes, such as shrinkage, roundness, indistinct boundaries, and nuclear pyknosis. An MTT assay indicated that the rate of inhibited prolifera tion was 100 %, 54.9%, 41.2%, 14.8%, and 12.4%, respectively. After treatment with 1%, 0.5%, or 0.1% XCH for 24 h, the rate of LX-2 cell proliferation was respectively 0.1 %, 5.3% , and 10.1% according to Edu. The level of expres sion of COL-I mRNA in LX-2 cells was 0.45±0.15 (P<0.05), 0.27±0.16 (P<0.01), and 0.38±0.24 (P<0.01), reflecting a significant decrease compared to 1.04±0.35 in the control group. MTT and Edu results indicated that XCH inhibited the proliferation of LX-2 cells in a dose-dependent manner. Conclusion XCH plays an antrfibrotic role by inhibiting the proliferation of LX-2 cells and the expression of COL-I mRNA in LX-2 cells.

　　[ Key words Xiaochaihu decoction; LX-2 cells; cell proliferation; schistosomiasis; liver fibrosis

　　血吸蟲蟲卵定植于肝臟，造成肝損傷進而導致一系列的肝臟病變，如肝臟炎癥、纖維化、肝腹水等[1，是血吸蟲病的主要臨床癥狀，其發生機制尚不十分明確，且尚無特效藥物，迫切需要篩選或研發新的抗纖維化藥物。中藥因具有多靶點、多途徑的作用特點，在臨床上應用廣泛[-3。小柴胡湯出自漢代張仲景的《傷寒論》，由柴胡、黃芩、人參、半夏、生姜、炙甘草、大棗七味中藥材組成，具有疏肝利膽的功效，常用于肝膽疾病的治療[。在病毒性肝炎、酒精性肝炎等引起的肝纖維化的治療中具有顯著療效[-句，且小柴胡湯可緩解血吸蟲感染引起的小鼠腸道損傷[，但是其對血吸蟲所致肝纖維化的作用尚不明確。有研究表明，肝星狀細胞的活化和增殖，細胞外基質(ECM)的沉積是肝纖維化形成的關鍵因素[。血吸蟲感染機體后，蟲卵沉積于肝臟引起肉芽腫，進而形成纖維化等一系列復雜的病理變化。動物實驗發現，小柴胡湯可延緩血吸蟲慢性感染引起的小鼠肝纖維化進程[1，推測小柴胡湯可能通過抑制肝星狀細胞增殖并減少細胞外基質的沉積，從而發揮其抗纖維化功效。

　　本研究旨在觀察小柴胡湯對人肝星狀細胞(LX-

　　2)體外增殖的影響，并分析其干預細胞活化和增殖的作用機制，為小柴胡湯用于治療血吸蟲病肝纖維化的臨床應用提供理論依據。

　　材料與方法

　　1材料

　　1.1 細胞 人肝星狀細胞株LX-2細胞購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。

　　1.2 試劑與儀器 DMEM高糖培養基(美國Hy clone公司，Cat：SH3002201);胎牛血清(美國Gibico公司，Cat：10270-106);胰酶(中國碧云天公司，Cat：C2020);Edur594細胞增殖檢測試劑盒(中國碧云天公司，Cat：C0078s);MTT試劑(中國碧云天公司，Cat：ST316);逆轉錄試劑盒(中國Vazyme公司，CAT：R323-01);qPCR Master Mix(中國Vazyme公司，CAT：Q711-02/03);細胞培養板(美國Corning公司，Cat：3516，3525，3599);細胞培養瓶(美國Corning公司，Cat：430614，430639);CO2培養箱(美國Themo Fisher公司);超凈工作臺(中國馮氏實驗動物設備有限公司，CJ-2F型);多功能檢測平臺(美國BD公司，SpectraMax i3);流式細胞儀(美國BD公司，BD Verse);熒光定量PCR儀(瑞士羅氏公司，Light Cy cler480);倒置熒光顯微鏡(德國Laica公司，DM14000)，高壓滅菌器(日本Tomy公司，SX-500);紫外分光光度計(美國Themo Fisher公司，Nanodrop 2000);分析天平(瑞士梅特勒公司，ME104)。

　　2方法

　　2.1 小柴胡湯制備 由南京中醫藥大學附屬無錫中醫醫院中藥房熱制。處方：參照《中國藥典》：柴胡48

　　g、黃芩18g、人參18g、半夏18g、炙甘草18g、生姜18 g、大棗80 g，共218g，熬至90ml。每1ml含有

　　2.42g中藥，將熬制的小柴胡湯離心去沉渣，經0.22

　　um濾膜過濾除菌，4 ℃保存備用，使用前37℃溫浴并稀釋到所需濃度。

　　2.2 細胞培養 取LX-2細胞復蘇后，用含10%胎牛血清、100U/ml青霉素和100ug/ml鏈霉素的DMEM培養基培養于37 ℃.5%cO2的培養箱中，細胞密度達80%時進行傳代。

　　2.3 MTT法檢測細胞增殖 收集處于對數生長期的L.X-2細胞，調整細胞濃度至1×10/ml，接種于96孔板，每孔1×10'個細胞。觀察細胞貼壁并恢復到正常狀態后，血清饑餓4h，實驗組分別用2%、1%.

　　0.5%、0.2%、0.1%小柴胡湯處理;對照組不做處理，每個組均做6個復孔，分別于2、4，8，24 h觀察細胞形態。小柴胡湯加入培養基作用20 h后加入MTT試劑繼續培養4h，吸棄上清，每孔加入150 pl DMSO

　　(二甲基亞碼)，測吸光度Aso值，計算細胞生長抑制率

　　(%)。細胞生長抑制率=[1-(實驗組平均A值÷對照組平均A值)]×100%

　　2.4 Edu法檢測細胞增殖 收集處于對數生長期的LX-2細胞，調整細胞濃度至1× 10/ml，接種于6孔板，每孔2×10"個細胞，貼壁后血清饑餓4 h，藥物刺激24 h后，每孔加入1 ml 37 ℃預熱的2XEdu工作液繼續孵育細胞2 h，按照試劑說明書方法固定、通透、洗滌、染色進行熒光檢測。

　　2.5 RT-PCR 細胞經小柴胡湯作用24h后提取總RNA，溶解于20 gl 0.1%DEPC(焦碳酸二乙酯)水中，紫外分光光度計測RNA濃度及純度，按照試劑說明書進行逆轉錄反應獲取CDNA，并進行RT-PCR反應，用磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)作為內參，通過2-法計算基因相對表達水平。COL-1引物F：5-

　　AGGGTCACCGTGGCTTCT-3;R：5-TCTGCTG-GCTCAGGCTCTT-3.GAPDH引物F：5 CG-GATTTGGTCGTATTGGG-3：R：5'-TGGAAGAT-GGTGATGGGATT-3，引物由上海生工生物工程有限公司合成。

　　2.6 統計學分析 實驗數據用均值士標準差(x±s)

　　表示，繪制軟件采用Graphpad Prism 6，組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

　　結果

　　1小柴胡湯對LX-2細胞形態的影響

　　小柴胡湯處理LX-2細胞24 h后，細胞形態出現不同程度改變(圖1)。空白對照組細胞貼壁生長良好，形態無明顯改變。與對照組相比，經2%小柴胡湯處理的細胞，大部分皺縮、變圓、界限不清、細胞核固縮;經1%、0.5%小柴胡湯處理的細胞也有不同程度的皺縮、變圓;經0.2%、0.1%小柴胡湯處理后，有一小部分細胞產生皺縮、變圓等形態學變化。

　　2 MTT檢測細胞增殖結果

　　利用2%、1%、0.5%，0.2%、0.1%小柴胡湯作用LX-2細胞24 h，MTT檢測細胞增殖抑制率，分別為100%，54.9%.41.2%.14.8%，12.4%(表1)。表明小柴胡湯對L.X-2細胞增殖起抑制作用，呈劑量依賴。

　　3 Edu檢測細胞增殖結果

　　1%、0.5%、0.1%小柴胡湯作用LX-2細胞24 h Edu法檢測其增殖率，分別為0.1%，5.3%，10.1%，與對照組細胞增殖率32%相比，差異均有統計學意義(P<0.05)(圖2，圖3)

　　4實時熒光定量PCR結果

　　LX-2細胞經1%，0.5%，0.1%小柴胡湯處理24 h后，RT-PCR檢測其COL-I mRNA的表達量分別為0.45+0.15(P<0.05)，0.27 +0.16(P<0.01)和0.380.24(P<0.01)，與對照組1.04±0.35相比，表達水平均顯著下降(表2).

　　討論

　　我國血吸蟲病防治已從傳播控制轉入傳播阻斷及消除階段，但仍存在大量晚期血吸蟲病患者，加之低度流行態勢下血吸蟲感染后蟲卵致肝病變過程較長，且機制復雜[0-13，給預防和治療帶來困難。因此，發展有效的抗纖維化藥物對于血吸蟲病治療意義重大。

　　肝星狀細胞(HSCs)的激活和增殖，以及細胞外基質(ECM)的過度沉積是肝纖維化形成的關鍵環節,多種細胞、細胞因子以及信號轉導途徑參與其中[-3]。有研究發現青蒿琥酯可通過調節1X-2細胞的增殖、凋亡和活化發揮抗纖維化作用[13)，。柴胡皂苷a通過線粒體依賴途徑誘導肝星狀細胞凋亡[2]，抑制纖維化進程。黃芩提取物可通過TGF-P1/SMAD信號通路降低HSCs 中a平滑肌肌動蛋白(a-SMA)和COI-1的表達，從而緩解纖維化[2].COL-1是細胞外基質的主要成分，也是肝纖維化檢測的標志物，同時也是HSCs活化的標志。TGF-B1信號通路與HSCs的活化密切相關[2)，下調TGF-1的表達可抑制HSCs活化[3]。有研究報道小柴胡湯顯著抑制日本血吸蟲感染小鼠肝臟TGF-B1，熱休克蛋白47(HSP47)、a-SMA，COI-1和11型膠原(COL-11)的表達，從而緩解血吸蟲感染引起的肝纖維化[

　　現有研究表明，多種中藥在肝纖維化的治療中具有顯著療效，并已應用于臨床[26])。中藥軟肝方(當歸、白芍、丹參、茜草、薏故仁、茯苓等)對于改善乙型肝炎肝硬化、肝纖維化水平療效顯著[2]。扶正化瘀膠囊(丹參、發酵蟲草菌粉、桃仁、松花粉等)可顯著改善日本血吸蟲病肝纖維化患者的肝功能，并在一定程度上降低肝纖維化指標[3]，小柴胡湯聯合干擾素a治療乙型肝炎纖維化療效顯著，且可顯著改善T細胞免疫狀態[3]。加味小柴胡湯治療酒精性肝纖維化，不但可改善患者臨床癥狀與體征及肝功能，而且能有效降低血清肝纖維化指標，促進肝臟組織修復，對酒精性肝纖維化療效較好，總有效率達86.67%。小柴胡湯作為一種傳統中藥方劑，在酒精性肝纖維化、乙型肝炎肝纖維化的治療中表現出良好的抗纖維化、抗炎效用。本研究觀察了小柴胡湯對體外培養LX-2細胞的作用，細胞形態學觀察、MTT以及Edu細胞增殖結果顯示，小柴胡湯可以抑制LX-2細胞的增殖，且存在明顯的量效關系，提示其可作為血吸蟲病肝纖維化的潛在治療藥物。同時，經不同濃度小柴胡湯處理后COL-ImRNA表達水平也顯著降低，說明小柴胡湯可通過抑制HSCs活化和增殖并降低COI-1在肝星狀細胞中的表達來發揮其抗纖維化活性，具有潛在的藥用價值。但關于小柴胡湯通過抑制肝星狀細胞增殖進而達到延緩血吸蟲肝纖維化的具體機制尚不十分明確，有待進一步研究。

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文章名稱： 小柴胡湯對體外培養LX-2細胞增殖的影響及機制初探

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