摘要：利用酶聯免疫吸附法原理建立了一種能夠定量測定果蔬、茶葉、煙葉中多菌靈殘留量的方法。通過酸堿中和化學反應，制備多菌靈半抗原，再通過免疫小鼠篩選出抗多菌靈單克隆抗體，制得酶標羊抗鼠抗抗體，并將制備出的抗多菌靈單克隆抗體和酶標羊抗鼠抗抗體用于酶聯酶聯免疫試劑盒的研制。結果表明，在0.1~8.1 ug/L的線性范圍內，目標物多菌靈線性關系良好，相關系數(R2)

　　可達到0.995。在300，600，1 200 ug/kg 3個添加水平下試劑盒的回收率為76.0%~102.2%，相對標準偏差均小于10%。試劑盒栓測煙葉、蘋果、白菜、茶葉樣本中的多菌靈，檢測限依次為266.3，421.0，349.1，484.4 pg/kg(n=20)。該方法屬于快速檢測方法，適用于果蔬、茶葉、煙葉中多菌靈殘留量的測。

　　關鍵詞：多茵靈;單克隆抗體;ELISA試劑盒

　　Abstract: Using the principle of enzyme-linked immunosorbent assay, a method for quantitative determination of carbendazim residues in fruits, vegetables, tea, and tobacco was established.

　　First, the carbendazim hapten was prepared through acid-base neutralization chemical reaction, and then the antrcarbendazim monoclonal antibody was screened out by immunizing mice to prepare the enzyme-labeled goat anti-mouse anti-antibody, and finally the prepared anti-carbendazim Monoclonal antibodies and enzyme-labeled goat anti-mouse antrantibodies were used in the development of enzyme-linked ELISA kits. The results showed that within the linear range of 0.1~8.1 ug/L., the target carbendazim had a good linear relationship, and the correlation coefficient (R2) could reach 0.995. The recoveries of the kits at the addition levels of 300, 600, and 1 200 g/kg were 76.0%~102.2%, and the relative standard deviations were all less than 10%. The kit detected carbendazim in tobacco leaves, apples, cabbage, and tea samples, and the detection limits were 266.3,421.0, 349.1, and 484.4 ug/kg (n = 20). This method was a rapid detection method and suitable for the determination of car bendazim residues in fruits, vegetables, tea, and tobacco leaves.

　　Keywords: carbendazim: monoclonal antibodies; enzyme linked immunosorbent assay kit

　　多菌靈(carbendazim)即N-2-苯并吡唑基)氨基甲酸甲酯，屬于苯并呲唑類，是一種病害防治殺菌劑，被廣泛應用于農作物。然而施用多菌靈的目標物會長期殘留該藥物，人、畜食用后，會引起頭暈、惡心、嘔吐、抽搐等一系列中毒癥狀[-2].

　　GB 2763-2019《食品安全國家標準 食品中農藥最大殘留限量》規定了果蔬、茶葉中多菌靈的最大殘留限量(Maximum Residue Limit，MRL)范圍為：0.02 ~5.00 mg/kg。目前中國的檢測標準有：GB/T 5009.188-2003《蔬菜、水果中甲基托布津、多菌靈的測定》、GB/T23380-200%水果、蔬菜中多菌靈殘留的測定 高效液相色譜法》，SN/T 3650-2013《藥用植物中多菌靈、噻菌靈和甲基硫菌靈殘留量的測定 液相色譜一質譜/質譜法》、SN/T 0162-2011《出口水果中甲基硫菌靈、硫菌靈、多菌靈、苯菌靈、噻菌靈殘留量的檢測方法 高效液相色譜法》、SN/T 1753-2016《出口濃縮果汁中甲基硫菌靈、噻菌靈、多菌靈和2-氨基苯并咪唑殘留量的測定 液相色譜一質譜/質譜法》、SN/T 0220-2016《出口水果中多菌靈殘留量的檢測方法》、NY/T 1680-2009《蔬菜水果中多菌靈等4種苯并咪唑類農藥殘留量的測定 高效液相色譜法》、NY/T 1453-2007《蔬菜及水果中多菌靈等16種農藥殘留測定 液相色譜一質譜一質譜聯用法》。上述標準均為儀器分析法，同時，通過查閱文獻發現，前人研究多菌靈檢測方法較多地偏重儀器方法，已報道的儀器方法有：超高效液相色譜法[3]、QuEChERS-高效液相色譜法(-3]、液相色譜一質譜/質譜法[6]、紫外分光光度法["]、液相色譜法-]、高效液相色譜法[o-1，、SERS法[2]等，分析對象主要為蔬菜、水果。此外，也有報道[13-1])利用酶聯免疫法快速檢測多菌靈的殘留量，但分析對象為土壤和水，目前尚未檢索到農產品中檢測多菌靈殘留量的快速檢測方法。而且儀器分析法成本高、步驟復雜，對檢測人員有較高的技術要求，不便于基層實驗室和中小型生產企業實施檢測。因此，研究擬采用酶聯免疫吸附法對煙葉、蘋果、白菜、茶葉中多菌靈殘留量進行檢測，以期提供一種成本低、效果好的方法，為農藥殘留監管提供技術支撐。

　　1材料與方法

　　1.1 材料與儀器

　　多菌靈、噻苯達唑、甲基托布津、托布津、2-氨基苯并咪唑標準品：純度>95%，北京標準物質研究中心;牛血清白蛋白：純度>98%，美國Sigma公司;卵清蛋白：純度>98%，美國Sigma公司;三氟乙酸、三氟乙酸酐、硝酸銨、氫氧化鈉、二氯甲烷、乙酸乙酯、氯化錫、碳二亞胺、石油醚、硫化銨、二甲基甲酰胺、碳酸鉀：分析純，北京百欣試劑公司;果蔬、茶葉、煙葉：市售;Balb/c小鼠：斯貝福(北京)生物技術有限公司;單克隆雜交瘤細胞株：實驗室自制;酶標儀：MK3型，上海雷勃分析儀器有限公司。

　　1.2抗原制備

　　1.2.1 半抗原制備 取三氟乙酸20 mL.加三氟乙酸酐2 mL，冰水浴至0℃，加硝酸銨0.5 g，攪拌1h，加入含多菌靈1.0 g的三氟乙酸溶液，繼續攪拌反應2h。停止攪拌，用1 mol/L氫氧化鈉溶液調節pH至7.0，加200 ml.

　　二氯甲烷萃取，加水300 mlL，充分攪拌，轉入分液漏斗中，靜置30 min，分層，分去上層水相，所得二氯甲烷溶液，旋蒸(40 ℃)，50 mL.乙醚打漿，得到化合物a 0.76 g.收率67%[]。在上述三氟乙酸和三氟乙酸酐體系下，用硝酸銨對多菌靈進行硝化反應，在苯環上引入硝基，萃取前進行中和，便于萃取.'H NMR(CDCl，，300 MHz)o：8.31(1H，dd.J=1.616，=1.239)，.7.69(1H，dd，J=8.716，J=1.616)，7.64(1H，dd，J=8.716.J=1.239)，3.85(3H，s)取化合物a 0.7g用乙醇溶解，加含0.43 g氯化錫的水溶液10 mL，通入氮氣，加熱回流反應3h;旋蒸(60 ℃)、除去乙醇，加水200 mlL，加乙酸乙酯100 mL，充分攪拌，靜置，分去水相，有機相旋蒸(55 ℃)以除去大部分乙酸乙酯，利用石油醚-乙酸乙酯(V石艇：VZ酸乙脂=

　　1：1)對其進行洗脫分離，得到b產物(半抗原化合物)0.54 g，收率為83%.'H NMR(CDCla，300 MHz)0：3.79(3H，s)，6.27(2H，s)，6.90(1H.dd.J=2.225.J=1.850)，6.46(1H，dd.J=8.422.J=2.225)，7.34(1H，dd.J=8.422.1=1.850)，5.00(1H，s)，9.15(1H，s)，上述產物經核磁共振氫譜測定，在化學位移8=6.27處存在苯環上芳香胺的共振吸收峰，說明半抗原合成成功。多菌靈半抗原合成路線見圖1.

　　1.2.2 免疫原制備 稱取牛血清白蛋白50 mg，使之充分溶解在3.8 mlL.0.1 mol/L，磷酸鹽緩沖液(pH 7.2)中得到溶液A;用0.2 mL H20溶解1-(3二甲氨基丙基)-3乙基碳二亞胺鹽酸鹽和N-A基琥酰亞胺各30 mg，加入至溶液A中，攪拌30 min;取15 mg半抗原，溶解于1 ml.二甲基甲酰胺溶液中，然后緩慢加入到溶液A中溶解，攪拌24 h。透析后分裝，-20℃保存。

　　1.2.3 包被原制備 稱取卵清蛋白50 mg，使之充分溶解在3.8 mL.0.1 mol/L，磷酸鹽緩沖液(pH 7.2)中，得到溶液B;用0.2 mL.H20溶解1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和N羥基琥珀酰亞胺各30 mg，加入至溶液B中，攪拌30 min;取13 mg半抗原，溶解于1ml.二甲基甲酰胺中，然后緩慢加入到溶液B中溶解，攪拌

　　24 h，透析后分裝，-20℃保存。

　　1.3 酶標記抗抗體制備

　　利用1.2得到的免疫原免疫Balb/c，制備雜交瘤細胞株，純化出多菌靈單克隆抗體[1]，免疫無病原體羊，得到羊抗鼠抗抗體[7，再用辣根過氧化物酶進行標記[]，得到標記抗抗體。

　　1.4 抗原包被濃度、單克隆抗體濃度選擇及酶標板制備(1)備抗依次進行1：2 000.1：4 000，18000的梯度稀釋，對制備的單克隆抗體依次進行1：10 000，1：20 000，1：40 000，1：80 000的梯度稀釋，測定波長為450 nm，按式(1)計算百分吸光率。к-× 100%，

　　(1)式中：K--百分吸光率，%;B--標準品或樣本溶液的平均吸光度值;B--0 ug/L，標準溶液的平均吸光度值。

　　(2)包被酶標板的抗原包被液體積為100 pL，需在37℃下孵育2h，再加入150 pL 0.02 mol/L PBS緩沖液，其中牛血清白蛋白的質量分數為0.05%，37℃下孵育2 h[13]，即完成酶標板制備。

　　1.5 煙葉中多菌靈殘留量測定

　　利用RIDAWIN數據分析軟件建立標準曲線，分別以待測藥物的標準品濃度、Logit(B/B，)為標準曲線的橫、縱坐標，將待測樣本的吸光度值代入該曲線，即可測定出多菌靈殘留量。

　　1.6 關鍵指標檢測

　　1.6.1 檢測限 取20份經過確證的空白樣本，利用1.5的方法檢測樣本濃度，并計算20份樣本濃度的標準差，所測樣本濃度的平均值與其3倍標準差之和即為檢測限[00)

　　1.6.2 精密度和準確度 將多菌靈標準品添加至煙葉樣本，添加濃度分別為300，600，1 200 ug/kg，檢測3個濃度的煙葉樣本回收率。煙葉樣本做4個平行，計算相對標準偏差(RSD).

　　1.6.3 穩定性 將試驗制備的試劑盒于4℃下存放，每月固定日期測定最大吸光度值(O yg/L)、試劑盒1Cso以及煙葉樣本的回收率，連續測定12個月。

　　1.6.4 抗體特異性 噻苯達唑、甲基托布津、托布津、

　　2-氨基苯并咪唑與多菌靈的結構類似，測定上述藥物的ICso，根據式(2)計算噻苯達唑、甲基托布津、托布津、2-氨基苯并咪唑的交叉反應率。引起50%抑制的多菌靈濃度與引起50%抑制的多菌靈類似物濃度的百分比，即為交叉反應率。

　　2結果與分析

　　2.1 抗原包被濃度、單克隆抗體濃度選擇測定濃度為0.0.0.1 yg/L的多菌靈標準品的吸光度值(見表1)，根據式(1)計算B(0.1 ug/L)/B，(0.0 g/L)

　　的百分吸光率。理論上在抗原數量一定的情況下，抗體只有達到一定數量才能有效結合，然而實際應用中，抗原和單克隆抗體作為制備酶聯免疫試劑盒的最關鍵原料，理想情況是在能夠保證有效反應的情況下，抗體量最小;稀釋倍數越大，同樣產量的原料能夠制備的試劑盒就越多。根據已有的研究[2]，如果能夠達到B(0.1 1g/L)/B

　　(0.0 yg/L)的百分吸光率在70%~85%的要求，那么稀釋倍數越大，原料就能節省得越多。因此，選擇抗原稀釋倍數為8000，單克隆抗體稀釋倍數為80 000。

　　2.2 標準曲線

　　利用RIDAWIN數據分析軟件建立標準曲線(見圖2)，標準曲線的范圍為0.0~8.1 ug/L，試劑盒的半數抑制濃度(ICso)為0.851 ug/L;得到的線性方程為：y=-1.686x+1.117，決定系數R2為0.995.

　　2.3 檢測限

　　由表2可知，該方法對煙葉、蘋果、白菜及茶葉樣本的檢測限分別為266.3，421.0，349.1，484.4 ug/kg。優于吳燕等[2]針對茶葉建立的基于表面增強拉曼光譜測定方法(定量限為2000 g/L)，GB 2763-2019食品安全國家標準 食品中農藥最大殘留限量》規定了多菌靈對蘋果、白菜、茶葉的最大殘留限量均為5 mg/kg(暫未對煙葉進行規定)。因此，該方法能夠滿足對多菌靈的檢測要求。

　　2.4 精密度和準確度

　　由表3可知，不同添加水平多菌靈的煙葉樣本的回收率為76.0%～102.2%，批內相對標準偏差為 4.8% ～9.7%，批間相對標準偏差為8.0%～8.6%。酶 聯 免 疫 試劑盒的準確性與 精 密 度 有 關，批內與批間的相對標準偏差均在10%以內，能保證測試的準確性。

　　2.5 穩定性

　　由表4可知，試劑盒于4 ℃保存能夠正常檢測12個 月，試驗期間其最大吸光度值 (0μg/L)范 圍 為 1.59～1.91，IC50范圍為0.367～0.772μg/L，煙葉樣本的回收率范圍為72.6%～95.3%，均未顯示異常。說明該酶聯免疫試劑盒的穩定性良好，在4 ℃下能夠保存12個月。

　　2.6抗體特異性

　　噻苯達唑、甲基托布津、托布津、2-氨基苯并咪唑為應用廣泛的殺菌劑。通過測定多菌靈抗體與噻苯達唑、甲基托布津、托布津、2-氨基苯并咪唑的交叉反應率，發現多菌靈抗體與噻苯達唑、甲基托布津、托布津、2-氨基苯并咪唑的交叉反應率<1%，說明多菌靈抗體的特異性良好。

　　3結論

　　試驗建立了一種煙葉、蘋果、白菜、茶葉中多菌靈殘留的酶聯免疫吸附方法，通過制備出特異性良好的多菌靈單克隆抗體，將其應用于酶聯免疫試劑盒的制備。結果表明，該方法穩定性好，檢測時間僅為45~60 min，并且不需要昂貴的儀器，適用于基層實驗室對煙葉、蘋果、白菜、茶葉中多菌靈殘留量進行批量檢測。GB 2763-2019《食品安全國家標準 食品中農藥最大殘留限量》規定了多菌靈對6種谷物、4種油料油脂、16種蔬菜、28種水果等食品類別的最大殘留限量，而試驗研究樣本僅限于蘋果、白菜等果蔬，今后可根據市場需求，結合該標準對樣本進行拓展。

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