摘要：采用牛津杯法和共培養法研究殼寡糖對雞源、豬源大腸桿菌(Escherichia coli 和沙門民菌(Salmonella)及乳酸菌的抑制作用。結果表明，牛津杯法未檢測到殼寡糖對病原菌的抑制作用;共培養法證實質量濃度為0.1 gmlL.0.2 g/mL和0.5 g/mL的殼寡糖對雞源、豬源大腸桿菌和沙門氏菌均具有顯著的抑菌作用(P<0.05)，且隨著殼寡糖質量濃度的升高，抑菌能力逐漸增強 0.2 g/mL的殼寡糖與乳酸菌共培養24 h對乳酸菌活菌數的影響不顯著(P>0.05)。為開發具有抑制畜禽腸道病原菌生長、預防腹瀉等作用的復合殼寡糖乳酸菌產品提供理論基礎。

　　關鍵詞：殼寡糖：抑菌作用：大腸桿菌：沙門氏菌;乳酸菌：共培養法

　　Abstract: The inhibitory effects of oligochitosan on Escherichia coli, Salmonella and lactic acid bacteria from chicken and pigs, were studied by Oxford cup method and co-culture method. The results showed that the inhibitorv effect of oligochitosan on pathogens was not detected by Oxford method. The co-culture method suggested that oligochitosan could significantly inhibit E. coli and Salmonella at the concentration of 0.1 g/ml, 0.2 g/ml and 0.5 g/ml, respectively

　　(P<0.05), and with the increase of oligochitosan, the antibacterial effect was improved gradually. There was no significant effect on the number of viable lactic acid bacteria (P>0.05) when 0.2 g/ml oligochitosan was co-cultivated with lactic acid bacteria for 24 h. It provided a theoretical basis for the development of composite oligochitosan-lactic acid bacteria products that could inhibit the growth of pathogenic bacteria in the intestinal tract of livestock and poultrv and prevent diarhea.

　　Key words: oligochitosan; antibacterial effect; Escherichia coli; Salmonella; lactic acid bacteria; co-culture methoc

　　殼聚糖是一種廣泛存在于自然界中，由蝦、蟹、昆蟲的幾丁質外殼經過不同程度地脫乙酰基而得到的一種無毒聚氨基葡萄糖"。殼寡糖(B-1，4寡糖-葡萄糖胺)是殼聚糖經物理、化學或特殊的生物酶降解得到的一種聚合度在2~20之間的寡糖產品，其水溶性好、功能作用大和生物活性高2。殼寡糖是天然糖中唯一大量存在的堿性氨基寡糖，綠色天然、無副作用，已經成為國際上新興的功能性低聚糖。殼寡糖由于易于吸收，功效顯著，已經作為生物保鮮劑 和飼料添加劑廣泛應用在醫藥領域、食品領域、化妝品領域和水產養殖領域等，主要用于降血脂、抗癌、抗氧化、抗衰老、提高免疫力等。

　　楊煥蝶等17研究發現，殼聚糖對大腸桿菌(Escherichia coli具有較好的抑菌作用，且較低的乙酰度和pH值更有利于殼聚糖發揮其抑菌活性。錢建瑛等研究發現，降低pH值、提高脫乙酰度和提高殼寡糖溶液濃度等能夠提高殼寡糖的抑菌活性。目前，殼寡糖作為功能性低聚糖也被廣泛應用在畜禽養殖中，研究發現殼寡糖能夠增殖有益菌，抑制有害菌生長，調節機體腸道微生態平衡。殼寡糖的抗菌性能是光譜性的，已有不少學者對其抑菌抗菌M、抗病毒11和抗腫瘤1等進行了研究。馮文娟等[2研究發現，殼寡糖對大腸桿菌、白色念珠菌(Candida albicans)和枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)具有良好的抑菌活性，對大腸桿菌的最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)和最低殺菌濃度(minimum bactericidal concentration，MBC)均為6.5g/L;對枯草芽孢桿菌的MIC和MBC均為1.5gL;錢建瑛等 研究發現，當殼寡糖質量濃度>5 mg/mL之后，抑菌效果與同質量濃度苯甲酸鈉相近，降低pH值、提高脫乙酰度、提高殼寡糖溶液質量濃度等都能提高殼寡糖的抑菌活性。目前，隨著國家對抗生素的使用要求越來越嚴格以及環保的壓力，在畜牧養殖領域，殼寡糖作為一種天然的免疫增強和炎癥調節活性物質，在增強動物免疫機能和抗炎方面具有較高的價值和應用前景"。

　　本研究采用牛津杯法和共培養法研究殼寡糖對雞源、豬源大腸桿菌和沙門氏菌(Salmonella)的抑菌作用以及殼寡糖對乳酸菌生長的影響，以期為開發殼寡糖和乳酸菌復合產品提供理論基礎。

　　1材料與方法

　　1.1材料與試劑

　　1.1.1主要試劑

　　殼寡糖(聚合度2~10，分子質量<2000 Da，純度為80%)：山東衛康生物醫藥科技有限公司;氯化鈉(分析純：天津博迪化工股份有限公司。其他試劑均為國產分析純。

　　1.1.2培養基

　　營養肉湯培養基、營養瓊脂培養基、MRS肉湯培養基、MRS瓊脂培養基、伊紅美蘭瓊脂培養基、木糖賴氨酸去氧膽酸鹽(xylose lysine deoxycholate，XLD)瓊脂培養基：青島海博生物技術有限公司。

　　1.1.3菌株

　　病原菌(雞源大腸桿菌菌株BLCC8-0102、雞源沙門氏菌菌株BLCC8-0104、豬源大腸桿菌菌株BLCC8-0001和豬源沙門氏菌菌株BLCC8-0063)：從患病畜禽病料中分離、鑒定，保存于本實驗室;乳酸菌菌株BLCC2-0015和BLCC2-0126：山東寶來利來生物工程股份有限公司研究院。

　　1.2儀器與設備

　　HPX-9082MBE電熱恒溫培養箱：上海博迅實業有限公司：SW-CJ-2F(2)超凈工作臺：蘇州安泰空氣技術有限公司：DHG-9140A電熱鼓風干燥箱：常州諾基儀器有限公司：HH4恒溫水浴鍋：國華電器有限公司：THZ-C恒溫振蕩器：揚州培英實驗儀器有限公司。

　　1.3方法

　　1.3.1牛津杯法測定殼寡糖對大腸桿菌和沙門氏菌的抑菌作用

　　分別將大腸桿菌和沙門氏菌以無菌操作稀釋一定倍數，取0.1mL均勻涂布于營養瓊脂培養基，放入牛津杯，每個杯中分別注入質量濃度為0.02 g/mL、0.10 gmL、0.20 g/mL和

　　0.50g/mL的殼寡糖溶液0.2 mL，37℃條件下培養24h，用游標卡尺測量抑菌圈直徑，設置營養肉湯培養基為陰性對照[13)

　　藥敏試驗判定標準：當抑菌圈直徑>15 mm時為高敏;介于10~15mm之間時為中敏：<10mm時為低敏

　　1.3.2共培養法檢測殼寡糖對大腸桿菌和沙門氏菌的抑菌作用

　　病原菌菌液的制備：從斜面挑取1環病原菌菌苔接種到營養肉湯培養基，裝液量為50mL/250 mL，于37 ℃C、180r/min條件下振蕩培養24 h，備用。

　　在營養肉湯培養基中分別添加質量濃度為0(空白細)、

　　0.02 g/mL.0.10 g/mL、0.20 g/mL和0.50 g/mL的殼寡糖，同時按1%(V/V的接種量接入培養好的病原菌菌液，37℃180r/min條件下振蕩培養，分別于2h和8h取樣檢測病原菌活菌數，大腸桿菌接種于伊紅美蘭瓊脂培養基，37℃條件下培養24 h進行菌落計數：沙門氏菌接種于XLD培養基，37 ℃條件下培養48h進行菌落計數。大桿菌按照GBT18869-2002《飼料中大腸菌群的測定》進行菌落計數：沙門氏菌按照GB 4789.4-2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗沙門氏菌檢驗》進行菌落計數。

　　1.3.3殼寡糖對乳酸菌的抑菌作用

　　乳酸菌菌液的制備：從斜面上挑取1環乳酸菌菌苔接

　　種到MRS肉湯培養基，裝液量為250 mL/250 mL，37℃靜置培養24 h，備用。

　　在MRS肉湯培養基中分別添加質量濃度為0(空白組)、

　　0.2 g/mL和1.0 gmL的殼寡糖，同時按照2%(VV的接種量接入上述準備好的乳酸菌菌液，于37℃條件下靜置培養，培養8h和24h時取樣檢測乳酸菌活菌數，檢測方法按照GB 4789.35-2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗乳酸菌檢驗》進行。

　　1.3.4數據處理與分析

　　試驗數據用Excel 2013軟件進行初步處理后，采用SPSS

　　13.0進行統計分析，采用One-way ANOVA進行方差分析，最小顯著差異(least significant difference，LSD)法進行組間多重比較，結果以“平均值土標準差”表示，P<0.05表示差異顯著。

　　2結果與分析

　　2.1殼寡糖對大腸桿菌和沙門氏菌的抑菌作用2.1.1牛津杯法檢測殼寡糖對大腸桿菌和沙門氏菌的抑菌作用

　　采用牛津杯法檢測殼寡糖對雞源和豬源大腸桿菌和沙門氏菌的抑菌作用，均未檢測到抑菌圈。

　　2.1.2共培養法檢測殼寡糖對雞源大腸桿菌和沙門氏菌的抑菌作用

　　沙門氏菌和大腸桿菌是兩種重要的人畜共患病致病菌，嚴重威脅畜禽健康、食品安全、人類健康和公共安全。大腸桿菌普遍存在于人類和畜禽腸道內，大部分血清型作為腸道內的共生菌是沒有毒性的，僅少數血清型的大腸桿菌具有致病性，可引起嚴重的腸道感染，給畜禽業造成嚴重損失。我國沙門氏菌有290多種血清型，不同血清型的沙門氏菌的致病性存在差異，能夠引起傷寒、副傷寒以及胃腸道疾病等。我國每年因沙門氏菌食物中毒的發病人數達300萬人次，其中近半數與生雞肉交叉污染有關。殼寡糖具有良好的藥理學作用和安全性以及多種有益的生物學活性，其中對炎性信號傳導通路的抑制被認為是其發揮抗炎作用的主要機制"。采用共培養法檢測殼寡糖對雞源大腸桿菌和沙門氏菌的抑制作用，結果見表1。

　　由表1可知，殼寡糖對雞源大腸桿菌的抑制作用：培養2 h時，與空白組相比，殼寡糖組除0.02 g/mL質量濃度外，大腸桿菌活菌數均顯著降低(P<0.05);培養8h時，與空白組相比，4個殼寡糖組大腸桿菌活菌數均顯著降低(P<0.05)，且隨著殼寡糖質量濃度的升高，抑菌能力逐漸增強。殼寡糖對雞源沙門氏菌的抑制作用：培養2h時，與空白組相比，

　　4個殼寡糖組沙門氏菌活菌數均顯著降低(P<0.05)，且隨著殼寡糖質量濃度的升高，抑菌能力逐漸增強;培養8h時，與空白組相比，殼寡糖組除0.02 g/mL質量濃度外，沙門氏菌活菌數均顯著降低(P<0.05)。有研究發現，在固體培養基中進行殼寡糖的抑菌試驗，發現對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌等有害菌具有抑制作用7。本試驗結果與已有研究一致，殼寡糖在抑制大腸桿菌和沙門氏菌方面效果顯著，具有抗炎作用。

　　2.1.3共培養法檢測殼寡糖對豬源大腸桿菌和沙門氏菌的抑菌作用

　　由表2可知，殼寡糖對豬源大腸桿菌的抑制作用：培養2 h時，與空白組相比，殼寡糖組除0.02 gmL質量濃度外，大腸桿菌活菌數均顯著降低(P<0.05);培養8h時，與空白組相比，4個殼寡糖組大腸桿菌活菌數均顯著降低(P<0.05)。

　　殼寡糖對豬源沙門氏菌的抑制作用：培養2h時，與空白組相比，殼寡糖組除0.02 g/mL質量濃度外，沙門氏菌活菌數均顯著降低(P<0.05);培養8h時，與空白組相比，4個殼寡糖組大腸桿菌活菌數均顯著降低(P<0.05)，且隨著殼寡糖質量濃度的升高，抑菌能力逐漸增強。

　　2.2殼寡糖對乳酸菌的抑制作用

　　大量研究表明，殼寡糖能夠改善動物腸道微生態環境，提高營養物質的消化吸收，促進動物生長。乳酸菌在調節免疫功能方面的機制尚不完全清楚，但其具有與有害菌競爭性排斥、產生抗菌物質和調節免疫反應的功能10目前，關于殼寡糖對乳酸菌抑制作用的報道較少，祁東風等1研究發現殼寡糖可抑制有害菌增殖，增加優勢菌群含量。但紀小敏等P研究發現，殼寡糖對保加利亞乳桿菌(Lactobacilus bulgaricus)和嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus的生長活性具有一定的抑制作用。本試驗通過共培養法檢測殼寡糖對乳酸菌的抑制作用，結果見表3。

　　由表3可知，殼寡糖對乳酸菌BLCC2-0015的抑制作用：培養8h時，與空白組相比，殼寡糖的添加，使得乳酸菌活菌數顯著降低(P<0.05);培養24h時，與對照組相比，添加

　　0.20 gmL的殼寡糖對乳酸菌活菌數影響不顯著(P>0.05)，添加0.50 g/mL的殼寡糖可顯著降低乳酸菌活菌數(P<0.05。殼寡糖對乳酸菌BLCC2-0126的抑制作用：培養8h和24h時，空白組相比，添加0.2 gmL的殼寡糖對照乳酸菌活菌數影響不顯著(P>0.05)，添加0.50 g/mL的殼寡糖顯著降低乳酸菌活菌數(P<0.05)。劉媛媛等[2研究發現，殼寡糖能增加斷奶仔豬有益微生物數量。但也有研究發現，日糧中添加250 mg/kg的殼寡糖能降低回腸中乳酸桿菌和大腸桿菌數量，顯著降低乳酸濃度2。本研究中0.5 g/mL的殼寡糖對乳酸菌具有抑制作用，0.2 g/mL的殼寡糖與乳酸菌共培養24h時對乳酸菌活菌數沒有影響，不具備抑制作用，說明

　　0.2 g/mL的殼寡糖與乳酸菌可以共同使用，不會產生抑制作用。

　　3結論

　　牛津杯法未檢測出殼寡糖對病原菌的抑制作用;共培養法證實質量濃度為0.1 g/mL.0.2 g/mL和0.5 g/mL的殼寡糖對雞源、豬源大腸桿菌和沙門氏菌均具有顯著的抑菌作用(P<0.05)，且隨著殼寡糖質量濃度的升高，抑菌能力逐漸增強：0.2 gmL殼寡糖與乳酸菌共培養24 h對乳酸菌活菌數的影響不顯著(P>0.05)。

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