[摘要] 目的 探究miRNA-375(miR-375)通過MYC/上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)對非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)侵襲和遷移的影響。

　　方法 將未做任何處理的NSCLC細(xì)胞A549作為空白組，轉(zhuǎn)染空載慢病毒的A549細(xì)胞作為對照組，轉(zhuǎn)染表達(dá)miR-375慢病毒的A549細(xì)胞作為實驗組。采用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)技術(shù)檢測miR-375在NSCLC組織和癌旁組織中的表達(dá)量，以及miR-375在正常肺組織細(xì)胞(BEAS-2B細(xì)胞)和A549細(xì)胞中的表達(dá)量;通過Transwell實驗檢測3組細(xì)胞的侵襲、遷移能力;采用Western blot檢測3組細(xì)胞中MYC蛋白和EMT相關(guān)蛋白(E-鈣黏蛋白、波形蛋白)的表達(dá)量。

　　結(jié)果 miR-375在NSCLC組織中的表達(dá)量顯著高于癌旁組織(t=16.88，P<0.05)，在A549細(xì)胞中的表達(dá)量顯著高于BEAS-2B細(xì)胞(t=8.51，P<0.05)。過表達(dá)miR-375后，實驗組與空白組和對照組相比，NSCLC細(xì)胞的侵襲(F=29.55，P<0.05)、遷移(F=90.21，P<0.05)能力增強，MYC蛋白表達(dá)增加(F=37.15，P<0.05)，E-鈣黏蛋白表達(dá)減少(F=47.25，P<0.05)，波形蛋白表達(dá)增加(F=77.64，P<0.05)。

　　結(jié)論 上調(diào)miR-375可以通過MYC/EMT影響NSCLC的侵襲和遷移能力。

　　[關(guān)鍵詞] 微RNAs;癌，非小細(xì)胞肺;基因，myc;上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化;細(xì)胞運動

　　肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，同時也是全球惡性腫瘤死亡的主要原因[1-2]，其中非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)占所有肺癌的80%以上[3]。NSCLC目前的主要治療方法是手術(shù)、放療和化療，盡管放療和化療的應(yīng)用使NSCLC預(yù)后得到很大改善，但其生存率還是很低[4]，所以NSCLC的靶向研究顯得尤為重要。近年來研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miRNA對肺癌的進展、診斷以及治療起著關(guān)鍵作用，其在肺癌的治療研究中備受關(guān)注[5]。miRNA是一類長約20個氨基酸的小RNA，它可以與特定的靶點結(jié)合，影響靶位點的mRNA翻譯，進而影響相關(guān)蛋白的表達(dá)[6]。有研究表明，miRNA-375(miR-375)與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移和凋亡有著密切的聯(lián)系，而且miR-375的表達(dá)與癌癥病人的總生存率相關(guān)，所以推測miR-375可能是一種有用的臨床預(yù)后生物標(biāo)志物[7-8]。JUNG等[9]研究發(fā)現(xiàn)，MYC可以受miR-375的調(diào)節(jié)進而影響腫瘤的進展和表型。MYC家族包括C-MYC、N-MYC和L-MYC，對腫瘤細(xì)胞的侵襲、遷移都有很重要的作用[10-11]。已有研究表明，一些藥物可以通過抑制MYC通路的激活來抑制人宮頸癌細(xì)胞的增殖、遷移和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)[12];hsa-miR-24則可以通過調(diào)節(jié)c-MYC/EMT軸來抑制鼻咽癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力[13];MYC還可以通過抑制RPS19/EMT信號傳導(dǎo)的激活來抑制癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[14]。本研究旨在探討miR-375是否可通過MYC/EMT對NSCLC的侵襲和遷移產(chǎn)生影響。

　　1 材料與方法

　　1.1 細(xì)胞與樣本

　　所用NSCLC細(xì)胞(A549)和正常肺組織細(xì)胞(BEAS-2B)由青島大學(xué)博雅樓實驗室凍存。A549細(xì)胞用RPMI-1640(HyClone，美國)培養(yǎng)液培養(yǎng)，BEAS-2B細(xì)胞用LHC-9(HyClone，美國)培養(yǎng)液培養(yǎng)，培養(yǎng)細(xì)胞時兩種培養(yǎng)液都加入體積分?jǐn)?shù)0.10胎牛血清(索萊寶，北京)。含EDTA的胰蛋白酶(索萊寶，北京)用于消化貼壁細(xì)胞。NSCLC組織和癌旁組織的新鮮樣本各30例，來自青島市市立醫(yī)院。本研究的組織來源病人均簽署了書面同意書，研究獲青島大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

　　1.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

　　將A549細(xì)胞接種于96孔板中，每孔10 000個，置于含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2的37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。實驗共分3組，在96孔板中未做任何處理的A549細(xì)胞作為空白組，將轉(zhuǎn)染含空載體慢病毒(吉凱基因公司，上海)的A549細(xì)胞作為對照組，將轉(zhuǎn)染表達(dá)miR-375慢病毒(吉凱基因公司，上海)的A549細(xì)胞作為實驗組。將3組細(xì)胞置于培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)10 h后，移除96孔板中的培養(yǎng)液，更換新的培養(yǎng)液，每孔100 μL。然后繼續(xù)培養(yǎng)72 h，應(yīng)用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)技術(shù)檢測3組細(xì)胞中miR-375的表達(dá)量。

　　1.3 qRT-PCR

　　收集長勢良好的細(xì)胞，按照iso plus RNA提取試劑盒(Takara，日本)的說明書提取3組細(xì)胞的總RNA，用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)(Takara，日本)將RNA反轉(zhuǎn)成cDNA，使用SYBR Premix Ex Taq RR420A(Takara，日本)進行qRT-PCR，檢測細(xì)胞中miR-375的表達(dá)。反應(yīng)條件：95 ℃、30 s;95 ℃、5 s，60 ℃、30 s，40個循環(huán);60 ℃、15 s。實驗所用引物均購自上海生工，其中U6作為miRNA-375的內(nèi)源性參照。引物序列見表1。

　　1.4 Transwell小室實驗

　　①遷移實驗：向24孔板(康寧，美國)的3個孔中加入含體積分?jǐn)?shù)0.15胎牛血清的培養(yǎng)液，每孔500 μL，將3個Transwell小室(康寧，美國)分別放入3個孔中。取3組細(xì)胞各5×104個分別接種于以上3個Transwell小室內(nèi)，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后取出，用棉簽擦拭3個Transwell小室的內(nèi)膜，之后小室用甲醇溶液固定10 min，用甲紫染色10 min，PBS洗3次，拍照，在顯微鏡下計數(shù)細(xì)胞。②侵襲實驗：將基質(zhì)膠(康寧，美國)與完全培養(yǎng)液按1∶9的比例稀釋，將稀釋后的混合液按每孔100 μL加入Transwell小室中，置于37 ℃培養(yǎng)箱中4 h，其余實驗步驟同遷移實驗。

　　1.5 Western blot檢測

　　取3組細(xì)胞，用PBS洗2次后加入1 mL的PBS，使用細(xì)胞刮刀將細(xì)胞刮下分別放入3個離心管中，以5 000 r/min離心5 min。去上清留細(xì)胞沉淀，在細(xì)胞沉淀中加入細(xì)胞裂解液和蛋白酶抑制劑，冰上裂解30 min，以12 000 r/min離心10 min，上清即為總蛋白。將提取的蛋白質(zhì)加入上樣緩沖液SDS-Loading Buffer，沸水浴煮5 min。取45 μg蛋白置SDS-PAGE凝膠中電泳，電泳結(jié)束后將膠中的蛋白條帶轉(zhuǎn)移到PVDF膜上(Millipore，美國)。用脫脂奶粉封閉2 h，在4 ℃下與MYC(1∶1 000，CST)、β-actin(1∶3 000，Bioss)、E-鈣黏蛋白(E-cadherin，1∶1 000，CST)、波形蛋白(Vimentin，1∶1 000，CST)的一抗一起孵育過夜;加入二抗(1∶1 000，Abcam)低速振蕩60 min。用超敏型化學(xué)發(fā)光底物試劑(ECL)進行蛋白條帶成像，分析條帶灰度值，計算各蛋白相對表達(dá)量。

　　1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

　　采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料結(jié)果以±s形式表示，兩組間比較采用配對t檢驗，多組間比較采用方差分析。以P<0.05表示差異有顯著性。

　　2 結(jié) 果

　　2.1 miR-375的表達(dá)

　　2.1.1 NSCLC組織和癌旁組織miR-375表達(dá)的比較 癌旁組織和NSCLC組織miR-375的相對表達(dá)量分別為0.40±0.20和1.00±0.03，NSCLC組織miR-375的表達(dá)明顯高于癌旁組織，差異有顯著性(t=16.88，P<0.05)。

　　2.1.2 BEAS-2B細(xì)胞和A549細(xì)胞miR-375表達(dá)的比較 BEAS-2B細(xì)胞和A549細(xì)胞miR-375的相對表達(dá)量分別為1.00±0.02和2.20±0.30，A549細(xì)胞miR-375的表達(dá)明顯高于BEAS-2B細(xì)胞，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=8.51，P<0.05)。

　　2.1.3 各組細(xì)胞miR-375表達(dá)的比較 實驗組細(xì)胞miR-375的表達(dá)較空白組和對照組明顯增加，差異有顯著性(F=1 677.95，P<0.05)，而空白組和對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

　　2.2 miR-375對細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響

　　與空白組和對照組相比，實驗組細(xì)胞的遷移、侵襲能力均增強，差異有顯著意義(F=90.21、29.55，P<0.05)，而空白組和對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

　　2.3 miR-375對MYC蛋白表達(dá)的影響

　　與空白組和對照組相比，實驗組細(xì)胞MYC的表達(dá)增加，差異有顯著意義(F=37.15，P<0.05)，而空白組和對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

　　2.4 miR-375對EMT相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

　　與空白組和對照組相比，實驗組細(xì)胞E-cadhe-

　　rin的表達(dá)降低，Vimentin的表達(dá)升高，差異均有顯著性(F=47.25、77.64，P<0.05)，而空白組和對照組E-cadherin和Vimentin的表達(dá)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖1和表3。

　　3 討 論

　　肺癌是全球范圍內(nèi)很常見的一種腫瘤，NSCLC在所有肺癌類型中發(fā)病率最高[15]。NSCLC確診時多數(shù)已發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移，這是其死亡率高的主要原因，所以研究影響NSCLC侵襲和轉(zhuǎn)移的靶點顯得尤為重要。miRNAs是小分子內(nèi)源性非編碼RNA，可以影響基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，從而起到腫瘤抑制基因或致癌基因的作用[16-17]。已有大量的證據(jù)表明，miRNAs對NSCLC的進展有影響[18-19]。在眾多的miRNAs中，越來越多的研究集中在miR-375上，miR-375與癌癥總體生存率顯著相關(guān)，并且對多種癌癥的侵襲、轉(zhuǎn)移、生長和分化產(chǎn)生作用[8，20]。但miR-375在NSCLC中的研究較少，它對NSCLC的影響還不甚明確，所以本研究選擇了miR-375作為NSCLC的研究靶點。

　　本研究結(jié)果顯示，miR-375在NSCLC組織中呈高表達(dá)，與相關(guān)研究結(jié)果一致[21]，推測miR-375在NSCLC中起促癌基因的作用。進一步的實驗結(jié)果顯示，過表達(dá)miR-375后細(xì)胞的侵襲和遷移能力增強，表明miR-375可以調(diào)節(jié)NSCLC的侵襲遷移能力，并且是起促癌基因的作用。但是也有研究結(jié)果顯示，miR-375在肺癌、食管癌、肝細(xì)胞癌中呈低表達(dá)[22-24]。目前miR-375在癌癥中具體的作用還不確定，其是否能作為癌癥治療的靶點還有待進一步證實。目前，綜合本實驗結(jié)果和相關(guān)文獻可以看出，miR-375既可以為癌基因，也可以為抑癌基因，

　　它在不同腫瘤中的作用不同。MYC癌蛋白為“超級轉(zhuǎn)錄因子”，可以調(diào)控基因組15%左右的轉(zhuǎn)錄，其下游效應(yīng)子可以參與核糖體生物合成、蛋白質(zhì)翻譯、協(xié)調(diào)細(xì)胞增殖和分化等生物功能[25-26]。本文實驗結(jié)果顯示，過表達(dá)miR-375后NSCLC細(xì)胞MYC蛋白的表達(dá)水平升高，表明miR-375可以通過調(diào)節(jié)MYC的表達(dá)來影響NSCLC的侵襲和遷移。EMT是一個動態(tài)變化的過程，在該過程中穩(wěn)定的上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為不穩(wěn)定的、具有轉(zhuǎn)移和侵襲能力的間質(zhì)細(xì)胞，故EMT在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演著不可或缺的角色[27-28]。MYC也可以通過調(diào)節(jié)EMT的發(fā)生發(fā)展來影響腫瘤進展[29]。本實驗結(jié)果表明，隨著miR-375的過表達(dá)，NSCLC細(xì)胞的MYC表達(dá)顯著增加，侵襲和遷移能力顯著增強，EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)也發(fā)生明顯變化，提示miR-375可以通過MYC/EMT影響NSCLC細(xì)胞的侵襲和遷移能力。

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