摘 要：為比較大腸桿菌(Escherichia coli)O157：H7產(chǎn)毒菌株耐受鹽酸和乳酸的差異性，首先采集309 份牛糞及牛肉樣，進(jìn)行菌株分離鑒定，接著采用多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)方法檢測(cè)分離株及其他收集菌株的4 種毒力基因(eae、hly、stx1、stx2)，進(jìn)而對(duì)攜帶毒力基因的產(chǎn)毒菌株分別進(jìn)行鹽酸和乳酸應(yīng)激實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明：共分離鑒定出8 株大腸桿菌O157菌株，樣品陽性檢出率為2.59%;毒力基因檢測(cè)表明，8 株菌株均不攜帶stx1和stx2基因，其中6 株菌株攜帶eae及hly基因;所有產(chǎn)毒菌株耐酸性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，鹽酸或乳酸處理2 h后20 株產(chǎn)毒菌株存活菌數(shù)均顯著下降(P<0.05)，但下降程度呈現(xiàn)明顯的菌株差異性，同一菌株對(duì)鹽酸、乳酸呈現(xiàn)明顯的耐受差異。

　　關(guān)鍵詞：大腸桿菌O157：H7;分離鑒定;耐酸性;菌株差異;產(chǎn)毒菌株

　　腸出血性大腸桿菌(enterohermorrhangic Escherichia coli，EHEC)是一種重要的人畜共患病原菌，也是食品中常見的食源性致病菌之一，O157：H7是其最主要的血清型[1]。大腸桿菌O157：H7感染劑量非常低，該菌吸附在宿主腸上皮細(xì)胞表面并分泌志賀毒素(shiga toxin，Stx)，可引起出血性腸炎、繼發(fā)性溶血性尿毒綜合癥等嚴(yán)重并發(fā)癥，重者可導(dǎo)致死亡。大腸桿菌O157：H7對(duì)人類健康的威脅已成為主要的世界性公共衛(wèi)生問題[2-3]。

　　許多食源性致病菌，如大腸桿菌O157：H7、傷寒沙門氏菌、單增李斯特菌等均為嗜中性菌，即在中性pH值環(huán)境下最適合生長(zhǎng)，低pH值環(huán)境不利于它們的生長(zhǎng)繁殖，因此降低pH值是食品加工中抑制致病菌的有效措施。乳酸通常被認(rèn)為是一種安全的有機(jī)酸，歐盟委員會(huì)于2013年批準(zhǔn)乳酸用于牛胴體表面，以降低微生物污染[4]。此外，機(jī)體胃液的低pH值環(huán)境可有效殺死食源性致病菌。然而，研究表明大腸桿菌O157：H7具有較高的耐酸性，在pH 2.0～2.5的低酸環(huán)境數(shù)小時(shí)，其生長(zhǎng)及繁殖未受到抑制[5-6]，這可能是該菌感染劑量較低的原因之一[7]。

　　關(guān)于酸應(yīng)激對(duì)食源性致病菌存活的影響，除了與酸種類有關(guān)外[8-9]，還與pH值、作用溫度、持續(xù)時(shí)間等密切相關(guān)[10-11]，

　　且無機(jī)酸(如HCl)和有機(jī)酸(如乳酸)應(yīng)激引起的微生物失活機(jī)制不同[7，12]。較多研究表明，食源性致病菌對(duì)各種應(yīng)激的耐受性存在菌株差異，而實(shí)際食品安全風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)和控制的對(duì)象一般是毒力基因陽性的產(chǎn)毒菌株。因此，本研究首先從牛糞及牛肉樣中分離、鑒定大腸桿菌O157：H7，選取產(chǎn)毒菌株與前期收集的其他產(chǎn)毒菌株一起進(jìn)行鹽酸和乳酸應(yīng)激處理，比較不同產(chǎn)毒菌株耐受鹽酸和乳酸的差異，為大腸桿菌O157：H7的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和科學(xué)有效控制提供科學(xué)依據(jù)。

　　1 材料與方法

　　1.1 菌種與試劑

　　前期收集了14 株大腸桿菌O157：H7：其中6 株(編號(hào)分別為CICC21530、NCTC12900、89、95、JS2和JS3)由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)江蘇省動(dòng)物源食品生產(chǎn)與安全保障重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng);8 株(編號(hào)分別為D1、109、110、111、112、113、114和115)由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院惠贈(zèng)。另外，大腸桿菌DH5α由江蘇省疾病控制與預(yù)防中心惠贈(zèng)。

　　改良EC肉湯(mEC+n)(modified E. coli broth)、胰蛋白胨大豆肉湯(tryptic soy broth，TSB)、胰蛋白胨大豆瓊脂(tryptic soy agar，TSA)、酵母浸粉(yeast extract，YE)及大腸桿菌O157：H7/NM干制生化鑒定試劑盒 北京陸橋技術(shù)有限公司;大腸桿菌O157和H7診斷血清、大腸桿菌O157膠體金快速檢測(cè)卡 上海慧耘生物有限公司;科馬嘉CHROMagarTM O157顯色培養(yǎng)基

　　上海欣中生物工程有限公司;抗E. coli O157免疫磁珠 北京東方賽瑞公司;聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)相關(guān)試劑 日本TaRaKa公司;大腸桿菌O157：H7的rfbO157、fliCH7、eae、hly、stx1和stx2引物的上、下游序列如表1所示[13-14]，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

　　1.2 儀器與設(shè)備

　　IS128C pH計(jì) 上海儀邁儀器科技有限公司;LDZX-30FBS立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠;SG403A Sterile GDRD生物安全柜 美國(guó)Baker公司;DHP-9052電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司;ZQTY-70臺(tái)式振蕩培養(yǎng)箱 上海知楚儀器有限公司;Mastercycler personal PCR儀 德國(guó)Eppendorf公司;Gel Doc 2000 system凝膠成像儀 美國(guó)Bio Rad

　　公司;TCL-16G高速離心機(jī) 上海安亭儀器廠;2-16KL高速冷凍離心機(jī) 美國(guó)Sigma公司。

　　1.3 方法

　　1.3.1 樣品采集

　　采集安徽3 個(gè)養(yǎng)牛場(chǎng)的牛糞樣250 份，南京集貿(mào)市場(chǎng)及超市牛肉樣59 份，共309 份。每份樣品分別放入一次性自封袋內(nèi)，置于低溫冰盒內(nèi)于24 h內(nèi)送至實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。

　　1.3.2 大腸桿菌O157：H7的分離、鑒定

　　以無菌操作取待檢樣25 g加入到含有225 mL mEC+n

　　肉湯的均質(zhì)袋中，在拍擊式均質(zhì)器上連續(xù)均質(zhì)1～2 min，于(36±1) ℃條件下培養(yǎng)24 h，參考GB 4789.36—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 大腸埃希氏菌O157：H7/NM檢驗(yàn)》[15]，應(yīng)用免疫磁珠法富集菌株，于科瑪嘉O157顯色平板進(jìn)行分離培養(yǎng)，可疑菌株進(jìn)行下一步鑒定。

　　1.3.2.1 特異基因的PCR檢測(cè)

　　O157特異基因rfbO157反應(yīng)體系(25 μL)：10×Buffer 2.5 μL、2.5 mmol/L dNTP 2 μL、Mg2+1.5 μL、rfbO157上下游引物各0.5 μL、Taq DNA聚合酶0.15 μL，ddH2O補(bǔ)足。rfbO157基因的反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性1 min，59 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，30 個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。H7特異基因fliCH7反應(yīng)體系25 μL：10×Buffer 2.5 μL、

　　25 mmol/L dNTP 0.5 μL、Mg2+1.5 μL、fliCH7上下游引物各0.25 μL、Taq DNA聚合酶0.125 μL，ddH2O補(bǔ)足。fliCH7基因的反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性7 min，94 ℃變性1 min，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，30 個(gè)循環(huán);72 ℃延伸5 min。引物序列及擴(kuò)增片段大小如表1所示。

　　1.3.2.2 生化鑒定

　　對(duì)O157特異基因rfbO157PCR反應(yīng)為陽性的可疑菌株，采用北京陸橋公司的DBI-06大腸埃希氏菌O157：H7/NM干制生化鑒定試劑盒進(jìn)行生化鑒定。

　　1.3.2.3 血清學(xué)鑒定

　　對(duì)O157特異基因rfbO157 PCR反應(yīng)為陽性的可疑菌株，用O157和H7診斷血清作玻片凝集實(shí)驗(yàn)。對(duì)于H7因子血清不凝集者，穿刺接種半固體瓊脂，檢查動(dòng)力，經(jīng)連續(xù)傳代3 次，動(dòng)力實(shí)驗(yàn)均為陰性，確定為無動(dòng)力株。

　　1.3.2.4 免疫膠體金快速檢測(cè)

　　對(duì)O157特異基因rfbO157 PCR反應(yīng)為陽性的可疑菌株，采用上海慧耘公司的Prajina大腸桿菌O157快速檢測(cè)卡進(jìn)行鑒定。

　　1.3.3 毒力基因檢測(cè)

　　對(duì)前期收集的14 株及上述分離鑒定的菌株進(jìn)行4 種毒力基因(stx1、stx2、eae、hly)多重PCR擴(kuò)增，以大腸桿菌CICC21530為陽性對(duì)照，以大腸桿菌DH5α為陰性對(duì)照，PCR反應(yīng)體系(50 μL)：10×Buffer 5 μL、10 mmol/L dNTP 1 μL、25 mmol/L Mg2+5 μL、eae上下游引物各1.5 μL、hly上下游引物各0.2 μL、stx1上下游引物各0.8 μL、stx2上下游引物各2.2 μL、Taq DNA聚合酶0.25 μL，ddH2O補(bǔ)足。四重PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性7 min，94 ℃變性40 s，56 ℃退火40 s，72 ℃延伸40 s，25 個(gè)循環(huán);72 ℃延伸5 min。

　　1.3.4 產(chǎn)毒菌株耐酸性比較實(shí)驗(yàn)

　　根據(jù)毒力基因檢測(cè)結(jié)果，選取毒力基因陽性菌株分別進(jìn)行鹽酸、乳酸耐受性比較。

　　菌液制備：將本實(shí)驗(yàn)室分離鑒定的菌株及購買和收集的菌株經(jīng)TSA劃線培養(yǎng)，37 ℃培養(yǎng)24 h，挑取單菌落接種于3 mL TSB中，37 ℃培養(yǎng)18 h，再轉(zhuǎn)接至100 mL TSB中，37 ℃培養(yǎng)18～20 h。

　　鹽酸和乳酸應(yīng)激處理：預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，采用鹽酸酸化的TSB(pH 3.5)處理菌液時(shí)，細(xì)菌存活率均較高，故進(jìn)一步采用鹽酸酸化的TSB(pH 2.0，模擬胃酸)、乳酸酸化的TSB(pH 3.5，模擬一些酸性食品)進(jìn)行酸應(yīng)激實(shí)驗(yàn)。

　　取活化2 次后的穩(wěn)定期菌液10 mL(約

　　9(lg(CFU/mL)))，于4 ℃、9 000×g條件下離心5 min，用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)

　　(pH 7.2)洗滌2 次，菌體沉淀分別重懸于等體積的鹽酸酸化的TSB(pH 2.0)和乳酸酸化的TSB(pH 3.5)中，37 ℃應(yīng)激反應(yīng)2 h，立即于上述條件下離心，沉淀用PBS洗滌重懸(終止酸應(yīng)激)[16]，用TSA-YE進(jìn)行培養(yǎng)計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，取平均值，按照下式進(jìn)一步計(jì)算存活率。

　　1.4 數(shù)據(jù)處理

　　菌株存活數(shù)用lg(CFU/mL)表示，采用SPSS V17.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果顯著性使用Duncan’s多重比較檢驗(yàn)，P<0.05表示存在顯著性差異。酸應(yīng)激后菌株存活率采用GraphPad Prism 7軟件進(jìn)行作圖。

　　2 結(jié)果與分析

　　2.1 菌株初步鑒定

　　大腸桿菌O157：H7在科瑪嘉顯色培養(yǎng)基上呈淺紅色至淡紫色，中心灰褐色。大腸菌群呈鐵藍(lán)色，變形桿菌等為無色至灰色。結(jié)果表明，309 份樣品中存在疑似菌株的有8 份，其中7 份為牛糞樣，1 份為牛肉樣。分離純化得到的疑似菌株進(jìn)行下一步鑒定。

　　2.2 基因rfbO157和fliCH7的PCR擴(kuò)增

　　采用PCR方法對(duì)疑似菌株進(jìn)行O型和H型鑒定，以大腸桿菌CICC21530為陽性對(duì)照菌株，結(jié)果如圖1～2所示，8 株菌的rfbO157基因均為陽性，其中6 株fliCH7基因陽性，2 株fliCH7基因陰性(菌株J29和菌株2G)。表明8 株菌鑒定為大腸桿菌O157，其中6 株菌為大腸桿菌O157：H7。

　　泳道1. 100 bp Ladder Marker;2. 陽性對(duì)照(大腸桿菌CICC21530);3. 陰性對(duì)照;4～11. 可疑菌株(編號(hào)依次為231、232、236、237、241、J29、J42及2G)。圖2同。

　　2.3 生化鑒定結(jié)果

　　上述8 株菌株進(jìn)一步用大腸桿菌O157：H7/NM干制生化鑒定試劑盒進(jìn)行生化鑒定，結(jié)果表明：8 株菌株均能夠發(fā)酵葡萄糖、乳糖、麥芽糖和甘露醇;發(fā)酵蔗糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣;M-R實(shí)驗(yàn)、吲哚實(shí)驗(yàn)陽性;VP實(shí)驗(yàn)、檸檬酸鹽利用實(shí)驗(yàn)陰性;不產(chǎn)生硫化氫。以上生化結(jié)果與大腸桿菌O157的生化特性相符合。

　　2.4 血清學(xué)鑒定結(jié)果

　　對(duì)PCR鑒定得到的8 株菌進(jìn)行血清學(xué)鑒定，以菌株CICC21530為陽性對(duì)照，結(jié)果表明，8 株菌均可與O157診斷血清發(fā)生凝集，其中有6 株可與H7診斷血清發(fā)生凝集，2 株與H7診斷血清不發(fā)生凝集(菌株J29和菌株2G)，血清學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果與PCR鑒定結(jié)果一致。

　　2.5 免疫膠體金快速檢測(cè)結(jié)果

　　采用大腸桿菌O157膠體金快速檢測(cè)卡對(duì)上述8 株菌株進(jìn)一步進(jìn)行檢測(cè)，以菌株CICC21530為陽性對(duì)照。陽性結(jié)果：C線顯色，T線肉眼可見;陰性結(jié)果：C線顯色，T線不顯色。結(jié)果表明，8 株菌均呈陽性，與rfbO157基因的PCR鑒定結(jié)果(圖1)一致。部分菌株檢測(cè)結(jié)果如圖3所示。

　　綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本研究檢出大腸桿菌O157陽性的樣品共8 份，陽性檢出率為2.59%(8/309)，其中牛糞陽性檢出率為2.80%(7/250)，牛肉陽性檢出率為1.69%(1/59)，牛糞陽性檢出率高于牛肉。陳雅君等[17]報(bào)道，糞便樣中陽性檢出率為0.67%，而牛乳和鮮肉中陽性檢出率為0%。Uhitil等[18]也報(bào)道，在牛肉和牛肉制品中沒有檢測(cè)到大腸桿菌O157。然而，另一些研究報(bào)道，在南非和馬來西亞的牛肉樣中，大腸桿菌O157陽性檢出率分別為74.5%和36.0%[19-20]，顯著高于本研究中牛肉樣的陽性檢出率。楊一群等[21]也報(bào)道，117 份食品樣中有55 份為rfbO157基因陽性，即大腸桿菌O157陽性檢出率高達(dá)47.01%。上述研究報(bào)道的差異與地區(qū)、牛群飼養(yǎng)管理、屠宰環(huán)境及屠宰工藝等有關(guān)。本研究的牛肉中檢出大腸桿菌O157，提示應(yīng)在加強(qiáng)防控大腸桿菌O157糞源污染的同時(shí)，更應(yīng)高度關(guān)注生肉及相關(guān)食品中致病菌的安全監(jiān)測(cè)。

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