泌尿系結(jié)石草酸鈣大鼠動(dòng)物模型腎結(jié)石是一種常見疾病，其中草酸鈣結(jié)石居多。因此實(shí)驗(yàn)動(dòng)物草酸鈣結(jié)石模型是腎結(jié)石基礎(chǔ)與臨床研究的重要方法。目前國內(nèi)主要通過乙二醇飲水法介導(dǎo)大鼠草酸鈣腎結(jié)石模型[1]。用小鼠誘導(dǎo)草酸鈣腎結(jié)石模型比較少見。目前認(rèn)為，小鼠較之于大鼠腎結(jié)石形成有較高的耐受性，草酸鈣晶體形成幾天后即被清除[2]。因此建立一個(gè)成石效果好，且簡便，經(jīng)濟(jì)的小鼠草酸鈣腎結(jié)石模型并研究小鼠腎內(nèi)一些結(jié)石相關(guān)的指標(biāo)變化及結(jié)晶清除機(jī)制，對(duì)研究腎結(jié)石的形成機(jī)制和指導(dǎo)臨床治療有重要的意義。

　　1材料

　　1.2試劑與儀器 乳酸脫氫酶(LDH)、丙二醛(MDA)、過氧化氫(H2O2)測試盒，南京建成生物工程研究;CD68兔抗小鼠多克隆抗體、即用型SABC免疫組化染色試劑盒、DAB顯色試劑盒，北京博奧森生物技術(shù)有限公司;乙二醇(分析純，天津市化學(xué)試劑一廠)。2550型紫外一可見光分光光度計(jì)(日本島津公司);病理圖像分析儀(德國萊卡公司)，離子色譜儀(德國DIONEX公司);自動(dòng)生化分析儀(美國雅培公司);LAMB DA BIO 20雙光束紫外分光光度計(jì)(美國PE公司);7170A自動(dòng)生化分析儀(日本日立公司) JAl203型電子天平(上海天平儀器廠)。

　　1.2 動(dòng)物昆明小白鼠40只，雄性，體重18～23 g，由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

　　2方法

　　2.1 動(dòng)物分組及給藥方法 動(dòng)物飼養(yǎng)1周后，選體重20-25 g 昆明小白鼠隨機(jī)分為4組，每組10只，正常顆粒飼料喂養(yǎng)。造模A組：1%乙二醇飲水;造模B組：1%乙二醇+10%葡萄糖酸鈣， ip 2mL/kg·d;造模C組：10%葡萄糖酸鈣，ip 2mL/kg·d 造模D組：正常飲水。各組小鼠均在相同的條件下飼養(yǎng)。造模共8周。

　　2.2 觀察指標(biāo)及檢測方法 實(shí)驗(yàn)結(jié)束前用代謝籠收集并測24 h尿量以及用于檢測尿草酸(離子色譜法)、尿鈣(自動(dòng)生化分析)、過氧化氫、乳酸脫氫酶、丙二醇的濃度。脫頸椎處死小鼠，切取小鼠的雙腎，觀察其外觀改變，右腎置10%中性福爾馬林中固定，作常規(guī)HE石蠟切片和Von Kossa染色及免疫組化，左腎精密稱重后計(jì)算各組大鼠的左腎/體重比值。

　　2.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以X±S 表示，用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。計(jì)量資料組間比較用One.Way ANOVA方差分析，LSD用于比較組內(nèi)差別。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

　　3 結(jié)果

　　3.1 動(dòng)物存活情況 各組至實(shí)驗(yàn)結(jié)束均無動(dòng)物死亡。

　　3.2 各組小鼠24h 尿草酸、鈣離子、左腎/體重比值

　　與D組比較，飲用了乙二醇的A、B組尿草酸排泄量顯著增加，但兩者之間無顯著差異(P>0.05);而腹腔注射了葡萄糖酸鈣的B、C組尿鈣排泄量顯著增加，但兩者間無顯著差異(P>0.05);與D組比較，B組腎臟/體重比值高于D組(P<0.05)。

　　3.3 各組小鼠24h 尿乳酸脫氫酶(LDH)、丙二醛(MDA)、過氧化氫(H2O2)含量

　　與D組比較，運(yùn)用了藥物干預(yù)的A、B、C 3組尿H2O2、LDH濃度顯著增加，但三者之間無顯著差異(P<0.05);A、B 2組尿液MDA、顯著增高(P<0.05)。

　　3.4 腎組織病理學(xué)檢查及鈣鹽染色檢查 腎臟病理檢查結(jié)果顯示，造模B組大鼠的腎體積均較對(duì)照組(D組)稍大，外觀灰白，表面觸摸粗糙不平。造模B組出現(xiàn)結(jié)晶，鏡下可見腎皮質(zhì)近曲小管大量結(jié)晶體(HE染色中晶體為淺黃或棕黃色，Von Kossa染色中晶體呈黑褐色)，結(jié)晶成堆分布相互連接，部分近曲腎小管細(xì)胞疏松水腫、遠(yuǎn)曲小管擴(kuò)張以及管腔內(nèi)可見脫落細(xì)胞，腎間質(zhì)血管充血，可見炎細(xì)胞。造模A、C組鏡下未見結(jié)晶體，僅發(fā)現(xiàn)腎間質(zhì)血管充血。免疫組化病理切片結(jié)果提示CD68主要表達(dá)于腎臟間質(zhì)，與D組比較，運(yùn)用了藥物干預(yù)的A、B、C 3組CD68灰度值顯著降低。

　　4討論

　　腎結(jié)石患者可出現(xiàn)高鈣、高草酸鹽、高無機(jī)磷、高鈉和低枸櫞酸尿等，其中鈣與草酸鹽的排泄量是形成結(jié)石的重要因素，而無機(jī)磷排出增加可使磷酸鹽易在尿中形成結(jié)晶，成為微小核心，介導(dǎo)異質(zhì)成核過程，導(dǎo)致草酸鈣結(jié)石的形成;本研究中各組模型動(dòng)物的各項(xiàng)腎損傷指標(biāo)結(jié)果以及病理切片觀察結(jié)果顯示，造模B組小鼠腎結(jié)石模型造模成功,A、C組均無結(jié)石形成，說明單獨(dú)增加尿草酸和尿鈣濃度不足以在小鼠體內(nèi)產(chǎn)生結(jié)晶，同時(shí)增加尿草酸和尿鈣濃度可以成功誘導(dǎo)小鼠草酸鈣腎結(jié)石。

　　腎結(jié)石動(dòng)物模型以及臨床腎結(jié)石患者腎臟處于氧化應(yīng)激的現(xiàn)象，而抗氧化治療可以減輕腎損傷和腎內(nèi)結(jié)晶情況，因此腎內(nèi)發(fā)生氧化應(yīng)激損傷在腎結(jié)石的發(fā)病過程中起到重要的作用[3, 4]。LDH為細(xì)胞內(nèi)酶成分，是胞漿標(biāo)志酶，只有在細(xì)胞壁受損傷的情況下才釋放到細(xì)胞外，是細(xì)胞受損傷的重要指標(biāo)之一。H2O2是活性氧簇中最主要的組成成分，其含量的多少可以反映ROS的含量。MDA是細(xì)胞脂質(zhì)過氧化反應(yīng)水平的重要指標(biāo)。本研究中造模A、B、C 3組尿液中LDH、MDA、H2O2含量均高于空白組，說明結(jié)石小鼠腎內(nèi)發(fā)生氧化應(yīng)激損傷。

　　小鼠較之于大鼠有較強(qiáng)的腎結(jié)石耐受性，有文獻(xiàn)報(bào)道小鼠腎內(nèi)草酸鈣晶體形成幾天后即被清除。這種清除的機(jī)制與腎內(nèi)單核/巨噬細(xì)胞的吞噬、轉(zhuǎn)運(yùn)清除能力有關(guān)[2, 5]。CD68是單核/巨噬細(xì)胞的表面標(biāo)志。本研究通過免疫組化的方法比較各組的巨噬細(xì)胞的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)造模A、B、C組的CD68灰度值明顯低于空白組，說明巨噬細(xì)胞表達(dá)高于空白組。表明巨噬細(xì)胞可能在腎結(jié)石的形成和/或清除過程中起到重要的作用。

　　乙二醇法是目前復(fù)制泌尿系統(tǒng)結(jié)石動(dòng)物模型比較成熟的方法，是草酸的前體，進(jìn)人體內(nèi)后轉(zhuǎn)化成羥乙酸，后者既可以在羥乙酸氧化酶的作用下直接轉(zhuǎn)化為草酸，也可以通過乳酸脫氧酶的催化轉(zhuǎn)化成乙醛酸，乙醛酸又可以直接在非酶作用下轉(zhuǎn)化為草酸。而傳統(tǒng)用于大鼠草酸鈣腎結(jié)石造模法的乙二醇飲水法應(yīng)用于小鼠未取得成功，本文通過同時(shí)增加尿鈣和尿草酸的方法成功建立小鼠草酸鈣腎結(jié)石，為以后建立小鼠腎結(jié)石模型和研究腎臟清除結(jié)晶的機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。