摘要：基因測(cè)序是一種新型基因檢測(cè)技術(shù)，能夠從血液或唾液中分析測(cè)定基因全序列，預(yù)測(cè)罹患多種疾病的可能性，如癌癥或白血病。基因測(cè)序相關(guān)產(chǎn)品和技術(shù)已由實(shí)驗(yàn)室研究演變到臨床使用，目前在眾多保健及醫(yī)療機(jī)構(gòu)和體檢中心，都打出基因測(cè)序的廣告，但其使用的基因測(cè)序儀及相關(guān)診斷試劑和軟件，很多沒(méi)有經(jīng)過(guò)醫(yī)療器械的注冊(cè)審批。對(duì)此，國(guó)務(wù)院有關(guān)部門(mén)高度重視。2014年2月，中國(guó)國(guó)家食藥監(jiān)管總局、國(guó)家衛(wèi)計(jì)委聯(lián)合發(fā)出通知，要求在相關(guān)準(zhǔn)入標(biāo)準(zhǔn)、管理規(guī)范出臺(tái)以前，任何醫(yī)療機(jī)構(gòu)不得開(kāi)展基因測(cè)序臨床應(yīng)用;已經(jīng)開(kāi)展的，要立即停止。

　　關(guān)鍵詞：基因測(cè)序,生物實(shí)驗(yàn),臨床診斷

　　近年間，基因測(cè)序從實(shí)驗(yàn)室走入臨床，甚至逐漸成為全球醫(yī)學(xué)界熱門(mén)的話題。其中一個(gè)很重要的原因，是“名人效應(yīng)”，蘋(píng)果公司創(chuàng)始人喬布斯和影星安吉麗娜·朱莉都曾采用基因測(cè)序方法希望抵御癌癥的侵襲，朱莉還為此預(yù)防性地切除自己的乳房。喬布斯雖然仍因癌癥去世，但他生前接受的全基因測(cè)序，已成為很多國(guó)家富人追捧的高端體檢服務(wù)。

　　基因測(cè)序，本是一種實(shí)驗(yàn)室研究技術(shù)手段，因“名人效應(yīng)”應(yīng)用于高端體檢、產(chǎn)前診斷等領(lǐng)域，價(jià)格不菲。基因測(cè)序最廣為人知的，是影星安吉麗娜·朱莉通過(guò)基因檢測(cè)，選擇手術(shù)切除乳腺以降低患乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)。2011年去世的蘋(píng)果公司創(chuàng)始人史蒂夫·喬布斯患癌時(shí)，也曾接受過(guò)全基因測(cè)序。

　　隨著人類(lèi)基因組計(jì)劃的完成,人類(lèi)對(duì)自身遺傳信息的了解和掌握有了前所未有的進(jìn)步。與此同時(shí),分子水平的基因檢測(cè)技術(shù)平臺(tái)不斷發(fā)展和完善,使得基因檢測(cè)技術(shù)得到了迅猛發(fā)展,基因檢測(cè)效率不斷提高。從最初第一代以 Sanger 測(cè)序?yàn)榇淼闹苯訖z測(cè)技術(shù)和以連鎖分析為代表的間接測(cè)序技術(shù),到 2005 年,以 Illumina 公司的 Solexa技術(shù)和 ABI 公司的 SOLiD 技術(shù)為標(biāo)志的新一代測(cè) 序 (next-generation sequencing,NGS) 的 相 繼 出現(xiàn),測(cè)序效率明顯提升,時(shí)間明顯縮短,費(fèi)用明顯降低,基因檢測(cè)手段有了革命性的變化。其技術(shù)正向著大規(guī)模、工業(yè)化的方向發(fā)展,極大地提高了基因檢測(cè)的檢出率,并擴(kuò)展了疾病在基因水平的研究范圍。2009 年 3 月,約翰霍普金斯大學(xué)的研究人員在《Science》雜志上發(fā)表了通過(guò) NGS外顯子測(cè)序技術(shù),發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的遺傳性胰腺癌的致病基因 PALB2,標(biāo)志著 NGS 測(cè)序技術(shù)成功應(yīng)用于致病基因的鑒定研究。同年,《Nature》發(fā)表了采用 NGS 技術(shù)發(fā)現(xiàn)罕見(jiàn)弗里曼謝爾登綜合征MYH3 致病基因突變和《Nat Genet》發(fā)表了遺傳疾病米勒綜合征致病基因。此后,通過(guò) NGS 技術(shù),與遺傳相關(guān)的致病基因不斷被發(fā)現(xiàn),NGS 技術(shù)已成為里程碑式的進(jìn)步。2010 年,《Science》雜志將這一技術(shù)評(píng)選為當(dāng)年“十大科學(xué)進(jìn)展”。

　　近兩年,基因檢測(cè)成為臨床診斷和科學(xué)研究的熱點(diǎn),得到了突飛猛進(jìn)和日新月異的發(fā)展,越來(lái)越多的臨床和科研成果不斷涌現(xiàn)出來(lái)。同時(shí),基因檢測(cè)已經(jīng)從單一的遺傳疾病專業(yè)范疇擴(kuò)展到復(fù)雜疾病和個(gè)體化應(yīng)用更加廣闊的領(lǐng)域,其臨床檢測(cè)范圍包括高危疾病的新生兒篩查、遺傳疾病的診斷和基因攜帶的檢測(cè)以及基因藥物檢測(cè)用于指導(dǎo)個(gè)體化用藥劑量、選擇和藥物反應(yīng)等諸多方面的研究。目前,基因檢測(cè)在臨床診斷和醫(yī)學(xué)研究的應(yīng)用正越來(lái)越受到醫(yī)生的普遍重視和引起研究人員的極大的興趣。

　　本文介紹了幾種 DNA 水平基因檢測(cè)常見(jiàn)的方法,比較其優(yōu)缺點(diǎn)和在臨床診斷和科學(xué)研究中的應(yīng)用,對(duì)指導(dǎo)研究生和臨床醫(yī)生課外學(xué)習(xí),推進(jìn)臨床科研工作和提升科研教學(xué)水平有著指導(dǎo)意義。

　　1、第一代測(cè)序

　　1.1 Sanger 測(cè)序 采用的是直接測(cè)序法。1977年,Frederick Sanger 等發(fā)明了雙脫氧鏈末端終止法,這一技術(shù)隨后成為最為常用的基因測(cè)序技術(shù)。2001 年,Allan Maxam 和 Walter Gibert 發(fā) 明了 Sanger 測(cè)序法,并在此后的 10 年里成為基因檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)。其基本原理即雙脫氧核苷三磷酸 (dideoxyribonucleoside triphosphate,ddNTP) 缺乏PCR 延伸所需的 3'-OH,因此每當(dāng) DNA 鏈加入分子 ddNTP,延伸便終止。每一次 DNA 測(cè)序是由 4個(gè)獨(dú)立的反應(yīng)組成,將模板、引物和 4 種含有不同的放射性同位素標(biāo)記的核苷酸的 ddNTP 分別與DNA 聚合酶混合形成長(zhǎng)短不一的片段,大量起始點(diǎn)相同、終止點(diǎn)不同的 DNA 片段存在于反應(yīng)體系中,具有單個(gè)堿基差別的 DNA 序列可以被聚丙烯酰胺變性凝膠電泳分離出來(lái),得到放射性同位素自顯影條帶。依據(jù)電泳條帶讀取 DNA 雙鏈的堿基序列。

　　人類(lèi)基因組的測(cè)序正是基于該技術(shù)完成的。Sanger 測(cè)序這種直接測(cè)序方法具有高度的準(zhǔn)確性和簡(jiǎn)單、快捷等特點(diǎn)。目前,依然對(duì)于一些臨床上小樣本遺傳疾病基因的鑒定具有很高的實(shí)用價(jià)值。例如,臨床上采用 Sanger 直接測(cè)序 FGFR 2 基因證實(shí)單基因 Apert 綜合征和直接測(cè)序 TCOF1 基因可以檢出多達(dá) 90% 的與 Treacher Collins 綜合征相關(guān)的突變。值得注意的是,Sanger 測(cè)序是針對(duì)已知致病基因的突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物,進(jìn)行 PCR 直接擴(kuò)增測(cè)序。單個(gè)突變點(diǎn)的擴(kuò)增包括該位點(diǎn)在內(nèi)的外顯子片段即可,不必將該點(diǎn)所在基因的全部外顯子都擴(kuò)增。

　　因此,應(yīng)明確定位要擴(kuò)增的位點(diǎn)所在的基因外顯子和該點(diǎn)的具體位置,設(shè)計(jì)包括該點(diǎn)在內(nèi)的上下游 150 ~ 200 bp 的外顯子片段引物。此外,盡管有NGS 的出現(xiàn),但 Sanger 測(cè)序?qū)τ谟兄虏』蛭稽c(diǎn)明確并且數(shù)量有限的單基因遺傳疾病的致病基因的檢測(cè)是非常經(jīng)濟(jì)和高效的。到目前為止,Sanger 測(cè)序仍然是作為基因檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn),也是 NGS 基因檢測(cè)后進(jìn)行家系內(nèi)和正常對(duì)照組驗(yàn)證的主要手段。

　　值得注意的是,Sanger 測(cè)序目的是尋找與疾病有關(guān)的特定的基因突變。對(duì)于沒(méi)有明確候選基因或候選基因數(shù)量較多的大樣本病例篩查是難以完成的,此類(lèi)測(cè)序研究還要依靠具有高通量測(cè)序能力的 NGS。雖然 Sanger 測(cè)序具有高度的分析準(zhǔn)確性,但其準(zhǔn)確性還取決于測(cè)序儀器以及測(cè)序條件的設(shè)定。另外,Sanger 測(cè)序不能檢測(cè)出大片段缺失或拷貝數(shù)變異等基因突變的類(lèi)型,因此對(duì)于一些與此相關(guān)的遺傳性疾病還不能做出基因?qū)W診斷。

　　1.2 連鎖分析 采用的是間接測(cè)序法。在 NGS 出現(xiàn)之前,國(guó)際通用的疾病基因定位克隆策略是建立在大規(guī)模全基因掃描和連鎖分析基礎(chǔ)上的位置候選基因克隆。人類(lèi)的染色體成對(duì)出現(xiàn),一條來(lái)自父親,一條來(lái)自母親,每一對(duì)染色體在同樣的位置上擁有相同的基因,但是其序列并不完全相同,被稱為父系和母系等位基因。遺傳標(biāo)記是指在人群中表現(xiàn)出多態(tài)現(xiàn)象的 DNA 序列,可追蹤染色體、染色體某一節(jié)段或某個(gè)基因座在家系中傳遞的任何一種遺傳特性。它存在于每一個(gè)人,但大小和序列有差別,具有可遺傳性和可識(shí)別性。目前采用第二代遺傳標(biāo)記,即重復(fù)序列多態(tài)性,特別是短串聯(lián)重復(fù)序列,又稱微衛(wèi)星標(biāo)記。連鎖分析是以連鎖這種遺傳現(xiàn)象為基礎(chǔ),研究致病基因與遺傳性標(biāo)記之間關(guān)系的方法。如果控制某一表型性狀的基因附近存在遺傳標(biāo)記,那么利用某個(gè)遺傳標(biāo)記與某個(gè)擬定位的基因之間是否存在連鎖關(guān)系,以及連鎖的緊密程度就能將該基因定位到染色體某一位置上。1986 年 Morton 等提出優(yōu)勢(shì)對(duì)數(shù)記分法 (log odds score method,LOD),主要檢測(cè)兩基因以某一重組率連鎖時(shí)的似然性。LOD 值為正,支持連鎖 ;LOD 值為負(fù),則否定連鎖。通過(guò)計(jì)算家系中的微衛(wèi)星標(biāo)記與致病位點(diǎn)之間的 LOD 值,可以初步估算二者間的遺傳距離及連鎖程度,從而確定該基因在染色體上的粗略位置。然后利用該區(qū)域的染色體基因圖譜,分析定位區(qū)域內(nèi)所有基因的功能與表達(dá),選擇合適的候選基因進(jìn)行突變檢測(cè),最終將致病基因定位或克隆。

　　然而,采用連鎖分析進(jìn)行基因檢測(cè)存在很大的局限性。不但所需遺傳樣本量較大,一般要求提供三代及以上遺傳家系患者血樣,而且數(shù)據(jù)量大、處理復(fù)雜、產(chǎn)出速度較慢、定位不夠精確 ( 一般只能定位在染色體某一區(qū)間 ),這就使得研究工作繁重和定位基因的時(shí)間周期特別長(zhǎng)。目前,連鎖分析采用的單核苷酸多肽性和短串聯(lián)重復(fù)序列還在使用,但經(jīng)典的間接測(cè)序方法,如單鏈構(gòu)象多肽性、變性梯度凝膠電泳和異源雙鏈分析在美國(guó)已被淘汰,而在發(fā)展中國(guó)家作為研究手段還在有限使用。

　　2、新一代測(cè)序 (NGS)

　　主 要 包 括 全 基 因 組 重 測(cè) 序 (whole-genomesequencing,WGS)、全外顯子組測(cè)序 (whole-exomesequencing,WES) 和目標(biāo)區(qū)域測(cè)序 (Targeted regionssequencing,TRS),它們同屬于新一代測(cè)序技術(shù)。總體而言,NGS 技術(shù)具有通量大、時(shí)間短、精確度高和信息量豐富等優(yōu)點(diǎn),使得遺傳學(xué)者可以在短時(shí)間內(nèi)對(duì)感興趣的基因進(jìn)行精確定位。但這些不同的測(cè)序技術(shù)在測(cè)序范圍、數(shù)據(jù)分析量以及測(cè)序費(fèi)用和時(shí)間等方面又有很大差別,如果選擇適合的方法,對(duì)于臨床診斷和科學(xué)研究將起到事半功倍的作用。

　　2.1 目標(biāo)區(qū)域測(cè)序 目前常用的是基因芯片技術(shù)。其測(cè)序原理是基于 DNA 雜交原理,利用目標(biāo)基因組區(qū)域定制的探針與基因組 DNA 進(jìn)行芯片雜交或溶液雜交,將目標(biāo)基因區(qū)域 DNA 富集,再通過(guò)NGS 技術(shù)進(jìn)行測(cè)序。其測(cè)序過(guò)程是通過(guò)把數(shù)以萬(wàn)計(jì)的 cDNA 或寡聚核苷酸置于芯片上制成列陣,將芯片上固定好的已知序列的核苷酸探針與溶液中含有熒光標(biāo)記的相應(yīng)核酸序列進(jìn)行互補(bǔ)配對(duì),根據(jù)測(cè)序儀所顯示強(qiáng)熒光的位置和強(qiáng)度,獲取每組點(diǎn)陣列信息,再利用生物信息學(xué)算法確定目的靶核苷酸的序列組成。測(cè)序所選定的目標(biāo)區(qū)域可以是連續(xù)的 DNA 序列,也可以是分布在同一個(gè)染色體不同區(qū)域或不同染色體上的片段。目標(biāo)區(qū)域測(cè)序技術(shù),對(duì)于以往通過(guò)連鎖分析將基因突變鎖定在染色體某一片段區(qū)域內(nèi),但無(wú)法找出突變是一個(gè)非常好的進(jìn)一步檢測(cè)手段。2010 年,Nicholas等使用基因分型芯片聯(lián)合連鎖分析技術(shù),成功發(fā)現(xiàn)頭小畸形的新基因 WDR62,文章發(fā)表在《NatGenet》雜志。類(lèi)似的研究在家族性胰腺癌中確定 8 個(gè)候選變異位點(diǎn)和在家族性滲出性玻璃體視網(wǎng)膜病變發(fā)現(xiàn)易感基因 TSPAN12。

　　基因芯片測(cè)序技術(shù)可以將經(jīng)過(guò)連鎖分析鎖定了目標(biāo)范圍或經(jīng)過(guò)全基因組篩選的特定基因或區(qū)域進(jìn)行更深一層的研究,是解決連鎖分析無(wú)法發(fā)現(xiàn)致病基因的有效手段。基因芯片技術(shù)對(duì)于已知基因突變的篩查具有明顯優(yōu)勢(shì),可以快速、全面地檢測(cè)出目標(biāo)基因突變。同時(shí),由于目標(biāo)區(qū)域受到了限制,測(cè)序范圍大幅度減少,測(cè)序時(shí)間和費(fèi)用相應(yīng)降低。但基因芯片檢測(cè)所需要的 DNA 的量要大,由于已提取的 DNA 存在降解的風(fēng)險(xiǎn),用于基因芯片研究的血標(biāo)本最好是冰凍的全血,這樣可以使用于檢測(cè) DNA 的量有充分保證。

　　全外顯子組測(cè)序 (WES) 外顯子組是單個(gè)個(gè)體的基因組 DNA 上所有蛋白質(zhì)編碼序列的總合。人類(lèi)外顯子組序列約占人類(lèi)全部基因組序列的 1%,但大約包含 85% 的致病突變。WES 是利用序列捕獲技術(shù)將全外顯子區(qū)域 DNA 捕捉并富集后進(jìn)行高通量測(cè)序的基因分析方法。采用的技術(shù)平臺(tái)主要是羅氏公司的 SeqCap EZ 全外顯子捕獲系統(tǒng),Illumina 公司的 Solexa 技術(shù)和 Agilent 公司的 SureSelect 外顯子靶向序列富集系統(tǒng)。其捕獲的目標(biāo)區(qū)在 34 ~ 62 M 之間,不僅包括編碼區(qū)同時(shí)也加入了部分非編碼區(qū)。NGS 的測(cè)序過(guò)程主要包括DNA 測(cè)序文庫(kù)的制備、錨定橋接、PCR 擴(kuò)增、單堿基延伸測(cè)序和數(shù)據(jù)分析。研究者根據(jù)測(cè)序儀捕獲到在測(cè)序過(guò)程中摻入有不同熒光標(biāo)記堿基片段,經(jīng)計(jì)算機(jī)將熒光信號(hào)轉(zhuǎn)化成不同顏色的測(cè)序峰圖和堿基序列。基因測(cè)序結(jié)果與NCBI的SNP數(shù)據(jù)庫(kù)、千人基因組數(shù)據(jù)庫(kù)等國(guó)際權(quán)威數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì),最終確定是否為突變基因。

　　自NGS 技術(shù)問(wèn)世以來(lái),利用 WES 在臨床疾病致病基因的鑒定研究中取得前所未有的成果。這些成果不僅集中在單基因遺傳疾病,還在多基因影響的復(fù)雜疾病中獲得大量相關(guān)基因的發(fā)現(xiàn)。在單基因遺傳性疾病中,如視網(wǎng)膜色素變性、終端骨發(fā)育不良等發(fā)現(xiàn)新基因或已知基因新突變。在一些罕見(jiàn)的疾病中,如 Kabuki 綜合征、家族性混合型低脂血癥和脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)癥等疾病中發(fā)現(xiàn)新的致病基因。同時(shí),在小細(xì)胞肺癌、慢性淋巴細(xì)胞性白血病等腫瘤研究和諸如肥胖癥、腦皮質(zhì)發(fā)育不良等復(fù)雜疾病的研究中也取得豐碩成果