摘要：為制定酒莊生產(chǎn)廢水灌溉的可行性、安全性標(biāo)準(zhǔn)提供理論依據(jù)，以寧夏回族志輝源石(ZHYS)、銀色高地(YSGD)、沃爾豐(WEF)、米擒(MQ)4個酒莊生產(chǎn)廢水灌溉區(qū)綠化帶土壤為研究對象，以清水灌溉區(qū)為對照，分析酒莊生產(chǎn)廢水灌溉對綠化帶土壤微生物群落與土壤理化性質(zhì)的影響，以及廢水灌溉區(qū)土壤理化性質(zhì)和微生物群落之間的關(guān)系。廢水灌溉后，4個酒莊土壤的pH值均升高，部分酒莊綠化帶土壤全鹽、有機(jī)質(zhì)含量較對照組升高，而全磷、速效鉀、速效磷含量降低。對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的分析表明：廢水灌溉使米擒和志輝源石酒莊土壤的香農(nóng)(Shannon)和Chao1指數(shù)降低。2種水質(zhì)灌溉下，優(yōu)勢種群均為變形菌門(Proteobacteria)，其次是酸桿菌門(Acidobacteria)和放線菌門(Actinobacteria)，其含量分別為26.34%～39.77%、18.77%～31.24%、4.45%～13.13%;廢水灌溉抑制了土壤中變形菌門、酸桿菌門、放線菌門微生物的生長，促進(jìn)了土壤中擬桿菌門(Bacteroidetes)微生物的生長。從屬水平變化來看，廢水灌溉降低了Gp4、Gp6在米擒和志輝源石酒莊的相對豐度，分別降低14.65%、19.69%和17.54%、10.99%。廢水灌溉降低了芽單胞菌屬(Gemmatimonas)在沃爾豐、銀色高地、志輝源石酒莊綠化帶土壤的相對豐度，分別降低23.95%、7.63%、29.67%;提高了Aridibacter的相對豐度，分別提高30.33%、13.44%、6.58%和24.24%。廢水灌溉提高了米擒、沃爾豐、銀色高地酒莊綠化帶土壤中Gp7的相對豐度，分別提高5.56%、24.32%、61.54%。堿解氮含量、電導(dǎo)率、速效鉀含量、全磷含量、pH值是影響綠化帶土壤微生物群落的主要環(huán)境因子。在嚴(yán)格把控廢水水質(zhì)指標(biāo)的情況下，用酒莊生產(chǎn)廢水灌溉綠化帶土壤是可行的。

　　關(guān)鍵詞：土壤微生物;生產(chǎn)廢水;酒莊;綠化帶;群落;理化性質(zhì)

　　我國2018年年用水總量為6 015.5億m3，其中農(nóng)業(yè)用水量占61.4%[1]，淡水資源短缺，環(huán)境問題日益嚴(yán)重，減少農(nóng)業(yè)用水量勢在必行。工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)用水緊張，我國北方地區(qū)分布較多干旱區(qū)域，水資源短缺成為限制農(nóng)業(yè)發(fā)展的主要因素，通常采用污水灌溉、節(jié)水措施來補(bǔ)充農(nóng)田灌溉用水不足的問題[2]。廢水灌溉是目前的研究熱點(diǎn)和難點(diǎn)，污水處理技術(shù)日益成熟，處理后的污水達(dá)到國家灌溉水質(zhì)要求后可用于灌溉農(nóng)田、草地園林等。污水灌溉既是污水的資源化利用，也是緩解水資源匱乏的有效措施[3]。化學(xué)需氧量(COD)在10 000 mg/L以上的葡萄酒廢水，屬于高濃度有機(jī)廢水，采用單一的工藝無法使出水達(dá)標(biāo)，國內(nèi)外一般采用組合工藝處理葡萄酒廢水[4]。

　　目前，相關(guān)研究多集中在城市生活污水、農(nóng)產(chǎn)品加工廢水、農(nóng)村生活用水、養(yǎng)殖廢水、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)廢水對土壤養(yǎng)分、微生物群落的影響等方面，這類污水的氨氮和COD含量較高，多環(huán)芳烴、重金屬等有毒有害物質(zhì)在水中含量較少，適用于農(nóng)業(yè)灌溉[4-8]。但是，關(guān)于酒莊廢水灌溉后對土壤各項指標(biāo)的影響，尤其是對土壤微生物群落影響的相關(guān)研究較少。土壤微生物被認(rèn)為是最有潛力的敏感性生物指標(biāo)之一[9]。土壤綜合肥力指數(shù)隨著微生物多樣性指數(shù)的升高呈上升趨勢。因此，研究酒莊生產(chǎn)廢水灌溉對綠化帶土壤微生物群落結(jié)構(gòu)與土壤理化性質(zhì)的影響具有重要意義。污水灌溉不僅會造成土壤污染，且污水中含有的N、P等營養(yǎng)元素，回灌后也會影響土壤養(yǎng)分含量，對土壤微生物及土壤酶活性產(chǎn)生一定的刺激作用。焦志華等研究發(fā)現(xiàn)，再生水灌溉會使大豆根際土壤中有機(jī)質(zhì)、有效磷含量增加，使土壤酶活性發(fā)生改變，同時再生水也會對大豆根際土壤中細(xì)菌及真菌數(shù)量造成一定的影響[4]。

　　寧夏回族自治區(qū)作為我國葡萄酒生產(chǎn)核心地區(qū)之一，優(yōu)質(zhì)水資源稀缺，而每年灌溉葡萄以及葡萄酒生產(chǎn)榨季的需水量很大。酒莊生產(chǎn)廢水的大量排放不僅造成區(qū)域環(huán)境污染，而且造成大量水資源的浪費(fèi)。酒莊生產(chǎn)廢水對環(huán)境有2個方面的效應(yīng)：一方面，廢水中含有大量的營養(yǎng)元素，這些元素是植物生長所必需的，如果根據(jù)相關(guān)水質(zhì)要求對酒莊生產(chǎn)廢水進(jìn)行處理，合理灌溉不僅能夠改善土壤環(huán)境、提高土壤肥力，而且還可以通過促進(jìn)土壤微生物的繁殖來影響植物的生長;另一方面，由于葡萄酒生產(chǎn)廢水含有高濃度的有機(jī)污染物，未經(jīng)處理而直接排放會對環(huán)境造成嚴(yán)重的污染，廢水散發(fā)臭味且高色度，須經(jīng)過一定處理達(dá)到國家排放的標(biāo)準(zhǔn)后方才可以排放。本研究采用經(jīng)過處理后的廢水灌溉綠化帶土壤，測定并分析土壤的細(xì)菌群落和土壤理化性質(zhì)的變化規(guī)律，從而探究酒莊廢水處理后灌溉綠化帶對土壤質(zhì)量的影響，以期為酒莊生產(chǎn)廢水再利用安全風(fēng)險評估指標(biāo)提供理論支撐。

　　1 材料與方法

　　1.1 研究區(qū)域概況

　　研究區(qū)域?qū)儆跍貛Т箨懶詺夂颍幱阢y川平原西部邊緣。土壤以礫石土為主，還有風(fēng)沙土、灌淤土以及未被開墾的戈壁荒灘，土壤貧瘠，有機(jī)質(zhì)含量低，透水性較強(qiáng)，土壤持水量低，降水量為150～240 mm。本研究以寧夏賀蘭山東麓米擒(MQ)、沃爾豐(WEF)、銀色高地(YSGD)、志輝源石(ZHYS)4個酒莊綠化帶土壤為研究對象，同時以酒莊生產(chǎn)廢水灌溉區(qū)和清水灌溉綠化帶土壤為對照，分析生產(chǎn)廢水灌溉對綠化帶土壤各項指標(biāo)的影響。綠化帶灌溉為滴灌，酒莊生產(chǎn)廢水經(jīng)一定措施處理后進(jìn)行灌溉，對照灌溉區(qū)則一直采用清水進(jìn)行灌溉。酒莊基本信息及其生產(chǎn)廢水水質(zhì)指標(biāo)如表1、表2所示。寧夏米擒、沃爾豐、銀色高地、志輝源石4個酒莊總排口廢水監(jiān)測到的各項指標(biāo)均符合GB 5084—2021《農(nóng)田灌溉水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)》的要求。因此，酒莊總排口廢水水質(zhì)適于灌溉。

　　1.2 土壤樣品采集及預(yù)處理

　　2019年9月分別采集4個酒莊的生產(chǎn)廢水灌溉區(qū)和正常灌溉區(qū)的土壤，采樣之前鏟除土壤表面的雜草和草根，每塊采樣地選取有代表性的樣點(diǎn)采集10～30 cm深度的土壤。在同一酒莊進(jìn)行多點(diǎn)采樣后充分混合，分成2個部分裝入無菌密封袋中，一部分土樣保存于4 ℃冰箱中用于測定土壤微生物多樣性，另一部分在室內(nèi)進(jìn)行風(fēng)干處理，揀去土樣中的雜物，用0.25 mm和1 mm的篩網(wǎng)分離土壤，裝入密封袋用于土壤理化性質(zhì)的測定。

　　1.3 土壤理化性質(zhì)測定

　　土壤pH值采用pH計測定(土水比為 1 g ∶2.5 mL)，全鹽含量采用電導(dǎo)率測定，堿解氮含量采用堿解擴(kuò)散法測定，重鉻酸鉀容量法(外加熱法)測定有機(jī)質(zhì)含量，凱氏定氮法測定全氮含量，用HClO4-H2SO4鉬銻抗比色法測定全磷含量，NaHCO3浸提法測定速效磷含量，乙酸銨浸提法測定速效鉀含量[10-11]。

　　1.4 土壤DNA提取

　　采用的是DNA試劑盒(MoBio PowerSoil DNA Isolation Kit)提取土壤樣品總DNA。DNA片段大小用濃度為1.0%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測[11-13]。

　　1.5 Illumina HiSeq測序及數(shù)據(jù)分析

　　本研究選取細(xì)菌的16S rRNA V4區(qū)基因片段進(jìn)行檢測，引物為515F/806R(5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′/5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)體系如下：15 μL 高保真聚合酶(New England Biolabs生產(chǎn))、0.2 μmol/L正反引物、10 ng DNA模板[11，13]。PCR產(chǎn)物檢測回收后進(jìn)行后續(xù)分析。

　　高通量測序由上海生工Illumina HiSeq 2500平臺運(yùn)行，所測目標(biāo)片段長度為250～300 bp[11-13]。原始數(shù)據(jù)(Tags數(shù)據(jù))經(jīng)所測得原始序列截去條形碼序列和引物序列后，經(jīng)FLASH(V1.2.7)拼接獲得。通過軟件QIIME處理過濾原始數(shù)據(jù)獲得高質(zhì)量Tags數(shù)據(jù)，并與數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對檢測嵌合體序列，獲得有效數(shù)據(jù)。對有效序列進(jìn)行聚類分析，利用RDP classifier(v2.2)軟件[12-16]與Greengenes數(shù)據(jù)庫進(jìn)行物種注釋，以獲得土壤樣品中細(xì)菌群落的多樣性信息。

　　土壤微生物主要進(jìn)行的是定性分析，即土壤微生物多樣性指數(shù)分析、微生物群落在門水平的變化分析、微生物群落在屬水平的變化分析、聚類分析、微生物群落在門水平相對豐度與土壤環(huán)境因子的冗余度排序分析(RDA)。微生物多樣性指數(shù)分析用來反映微生物群落的多樣性，指數(shù)越大表明群落的復(fù)雜程度也越高;可從門、屬水平來分析微生物群落構(gòu)成差異。經(jīng)過RDA可以檢測土壤環(huán)境、樣品、群落結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系。

　　1.6 數(shù)據(jù)處理

　　采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行差異顯著性分析;微生物群落在門、屬水平用物種豐度柱形堆積圖來表示，用R的gplots package軟件進(jìn)行分析;微生物群落在門水平相對豐度與環(huán)境因子相關(guān)性分析，采用RDA法，所用軟件同上。

　　2 結(jié)果與分析

　　2.1 土壤理化性質(zhì)

　　如表3所示，4個酒莊的土壤pH值為9.30～9.58，屬于典型的堿性土壤。各酒莊生產(chǎn)廢水灌溉土壤的pH值均略高于清水灌溉。除了銀色高地酒莊(YSGD)之外，其他3個酒莊廢水灌溉土壤與清水灌溉土壤pH值差異顯著(P<0.05)。除志輝源石酒莊(ZHYS)和沃爾豐(WEF)之外，其他2個采樣地廢水灌溉土壤電導(dǎo)率高于清水灌溉;其中，米擒(MQ)、銀色高地(YSGD)廢水灌溉區(qū)土壤電導(dǎo)率分別比清水灌溉高38.78%和7.87%。速效鉀含量在廢水灌溉土壤中均明顯低于清水灌溉區(qū);其中，沃爾豐(WEF)、志輝源石(ZHYS)廢水灌溉土壤速效鉀含量分別顯著低于清水灌溉區(qū)23.53%和30.81%(P<0.05)。廢水灌溉區(qū)土壤速效磷含量均低于清水灌溉區(qū);其中，沃爾豐(WEF)與志輝源石(ZHYS)廢水灌溉區(qū)速效磷含量分別低于對照組19.0%和5.8%。廢水灌溉的大部分土壤中全磷含量均低于清水灌溉區(qū)，其中志輝源石酒莊(ZHYS)廢水處理土壤全磷含量高于清水灌溉55.32%。米擒酒莊(MQ)與沃爾豐(WEF)酒莊廢水灌溉土壤有機(jī)質(zhì)含量高于清水灌溉土壤31.29%和3.45%(P<0.05);在銀色高地(YSGD)和志輝源石(ZHYS)廢水灌溉土壤有機(jī)質(zhì)含低于清水灌溉區(qū)，其中志輝源石酒莊(ZHYS)與CK土壤有機(jī)質(zhì)含量差異顯著。米擒酒莊(MQ)廢水灌溉土壤堿解氮含量最高，為17.03 mg/kg，高于對照組73.78%，其他3個酒莊土壤堿解氮含量差異不顯著。

　　2.2 土壤細(xì)菌多樣本聚類分析

　　在聚類分析中，樣本之間的距離以樹枝長度表示，當(dāng)樣本聚集到一起時其相似度越高。如圖1所示，將相似性標(biāo)準(zhǔn)值定位0.8，樣本可分成2類：一類是米擒酒莊(MQ、MQ_CK)，另一類是志輝源石、沃爾豐、銀色高地酒莊(ZHYS_CK、ZHYS、WEF_CK、WEF、YSGD_CK、YSGD)。廢水灌溉與清水灌溉使得銀色高地酒莊(YSGD、YSGD_CK)土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的差異較大，其他酒莊的2種水灌溉對土壤細(xì)菌群落影響較小。

　　2.3 土壤微生物多樣性指數(shù)

　　微生物群落多樣性指標(biāo)包括香農(nóng)指數(shù)(Shannon)、Chaol、辛普森指數(shù)(Simpson)及分類操作單元(OTU)，常被用于評價土壤微生物功能多樣性，它們的指數(shù)越高，表明樣品中的物種多樣性程度越高。如表4所示，OTU數(shù)目在米擒酒莊(MQ)廢水灌溉處理中最低;在志輝源石酒莊(ZHYS)廢水灌溉的土壤中OTU數(shù)目顯著少于清水灌溉處理。在米擒(MQ)和志輝源石酒莊(ZHYS)土壤廢水灌溉處理中Shannon指數(shù)低于清水灌溉，且在米擒酒莊(MQ)廢水灌溉的土壤細(xì)菌群落多樣性最低。在米擒(MQ)和志輝源石(ZHYS)酒莊土壤廢水灌溉處理中Chao1指數(shù)低于清水灌溉，且在米擒酒莊(MQ)用廢水灌溉的土壤細(xì)菌群落多樣性最低;Simpson指數(shù)在米擒酒莊(MQ)廢水灌溉土壤中達(dá)到最大值，在WEF、YSGT采樣地Simpson指數(shù)與CK沒有顯著差異。

　　推薦閱讀：現(xiàn)代食品微生物檢測技術(shù)分析