摘要：為制定酒莊生產廢水灌溉的可行性、安全性標準提供理論依據，以寧夏回族志輝源石(ZHYS)、銀色高地(YSGD)、沃爾豐(WEF)、米擒(MQ)4個酒莊生產廢水灌溉區綠化帶土壤為研究對象，以清水灌溉區為對照，分析酒莊生產廢水灌溉對綠化帶土壤微生物群落與土壤理化性質的影響，以及廢水灌溉區土壤理化性質和微生物群落之間的關系。廢水灌溉后，4個酒莊土壤的pH值均升高，部分酒莊綠化帶土壤全鹽、有機質含量較對照組升高，而全磷、速效鉀、速效磷含量降低。對土壤微生物群落結構的分析表明：廢水灌溉使米擒和志輝源石酒莊土壤的香農(Shannon)和Chao1指數降低。2種水質灌溉下，優勢種群均為變形菌門(Proteobacteria)，其次是酸桿菌門(Acidobacteria)和放線菌門(Actinobacteria)，其含量分別為26.34%～39.77%、18.77%～31.24%、4.45%～13.13%;廢水灌溉抑制了土壤中變形菌門、酸桿菌門、放線菌門微生物的生長，促進了土壤中擬桿菌門(Bacteroidetes)微生物的生長。從屬水平變化來看，廢水灌溉降低了Gp4、Gp6在米擒和志輝源石酒莊的相對豐度，分別降低14.65%、19.69%和17.54%、10.99%。廢水灌溉降低了芽單胞菌屬(Gemmatimonas)在沃爾豐、銀色高地、志輝源石酒莊綠化帶土壤的相對豐度，分別降低23.95%、7.63%、29.67%;提高了Aridibacter的相對豐度，分別提高30.33%、13.44%、6.58%和24.24%。廢水灌溉提高了米擒、沃爾豐、銀色高地酒莊綠化帶土壤中Gp7的相對豐度，分別提高5.56%、24.32%、61.54%。堿解氮含量、電導率、速效鉀含量、全磷含量、pH值是影響綠化帶土壤微生物群落的主要環境因子。在嚴格把控廢水水質指標的情況下，用酒莊生產廢水灌溉綠化帶土壤是可行的。

　　關鍵詞：土壤微生物;生產廢水;酒莊;綠化帶;群落;理化性質

　　我國2018年年用水總量為6 015.5億m3，其中農業用水量占61.4%[1]，淡水資源短缺，環境問題日益嚴重，減少農業用水量勢在必行。工農業生產用水緊張，我國北方地區分布較多干旱區域，水資源短缺成為限制農業發展的主要因素，通常采用污水灌溉、節水措施來補充農田灌溉用水不足的問題[2]。廢水灌溉是目前的研究熱點和難點，污水處理技術日益成熟，處理后的污水達到國家灌溉水質要求后可用于灌溉農田、草地園林等。污水灌溉既是污水的資源化利用，也是緩解水資源匱乏的有效措施[3]。化學需氧量(COD)在10 000 mg/L以上的葡萄酒廢水，屬于高濃度有機廢水，采用單一的工藝無法使出水達標，國內外一般采用組合工藝處理葡萄酒廢水[4]。

　　目前，相關研究多集中在城市生活污水、農產品加工廢水、農村生活用水、養殖廢水、農業生產廢水對土壤養分、微生物群落的影響等方面，這類污水的氨氮和COD含量較高，多環芳烴、重金屬等有毒有害物質在水中含量較少，適用于農業灌溉[4-8]。但是，關于酒莊廢水灌溉后對土壤各項指標的影響，尤其是對土壤微生物群落影響的相關研究較少。土壤微生物被認為是最有潛力的敏感性生物指標之一[9]。土壤綜合肥力指數隨著微生物多樣性指數的升高呈上升趨勢。因此，研究酒莊生產廢水灌溉對綠化帶土壤微生物群落結構與土壤理化性質的影響具有重要意義。污水灌溉不僅會造成土壤污染，且污水中含有的N、P等營養元素，回灌后也會影響土壤養分含量，對土壤微生物及土壤酶活性產生一定的刺激作用。焦志華等研究發現，再生水灌溉會使大豆根際土壤中有機質、有效磷含量增加，使土壤酶活性發生改變，同時再生水也會對大豆根際土壤中細菌及真菌數量造成一定的影響[4]。

　　寧夏回族自治區作為我國葡萄酒生產核心地區之一，優質水資源稀缺，而每年灌溉葡萄以及葡萄酒生產榨季的需水量很大。酒莊生產廢水的大量排放不僅造成區域環境污染，而且造成大量水資源的浪費。酒莊生產廢水對環境有2個方面的效應：一方面，廢水中含有大量的營養元素，這些元素是植物生長所必需的，如果根據相關水質要求對酒莊生產廢水進行處理，合理灌溉不僅能夠改善土壤環境、提高土壤肥力，而且還可以通過促進土壤微生物的繁殖來影響植物的生長;另一方面，由于葡萄酒生產廢水含有高濃度的有機污染物，未經處理而直接排放會對環境造成嚴重的污染，廢水散發臭味且高色度，須經過一定處理達到國家排放的標準后方才可以排放。本研究采用經過處理后的廢水灌溉綠化帶土壤，測定并分析土壤的細菌群落和土壤理化性質的變化規律，從而探究酒莊廢水處理后灌溉綠化帶對土壤質量的影響，以期為酒莊生產廢水再利用安全風險評估指標提供理論支撐。

　　1 材料與方法

　　1.1 研究區域概況

　　研究區域屬于溫帶大陸性氣候，處于銀川平原西部邊緣。土壤以礫石土為主，還有風沙土、灌淤土以及未被開墾的戈壁荒灘，土壤貧瘠，有機質含量低，透水性較強，土壤持水量低，降水量為150～240 mm。本研究以寧夏賀蘭山東麓米擒(MQ)、沃爾豐(WEF)、銀色高地(YSGD)、志輝源石(ZHYS)4個酒莊綠化帶土壤為研究對象，同時以酒莊生產廢水灌溉區和清水灌溉綠化帶土壤為對照，分析生產廢水灌溉對綠化帶土壤各項指標的影響。綠化帶灌溉為滴灌，酒莊生產廢水經一定措施處理后進行灌溉，對照灌溉區則一直采用清水進行灌溉。酒莊基本信息及其生產廢水水質指標如表1、表2所示。寧夏米擒、沃爾豐、銀色高地、志輝源石4個酒莊總排口廢水監測到的各項指標均符合GB 5084—2021《農田灌溉水質標準》的要求。因此，酒莊總排口廢水水質適于灌溉。

　　1.2 土壤樣品采集及預處理

　　2019年9月分別采集4個酒莊的生產廢水灌溉區和正常灌溉區的土壤，采樣之前鏟除土壤表面的雜草和草根，每塊采樣地選取有代表性的樣點采集10～30 cm深度的土壤。在同一酒莊進行多點采樣后充分混合，分成2個部分裝入無菌密封袋中，一部分土樣保存于4 ℃冰箱中用于測定土壤微生物多樣性，另一部分在室內進行風干處理，揀去土樣中的雜物，用0.25 mm和1 mm的篩網分離土壤，裝入密封袋用于土壤理化性質的測定。

　　1.3 土壤理化性質測定

　　土壤pH值采用pH計測定(土水比為 1 g ∶2.5 mL)，全鹽含量采用電導率測定，堿解氮含量采用堿解擴散法測定，重鉻酸鉀容量法(外加熱法)測定有機質含量，凱氏定氮法測定全氮含量，用HClO4-H2SO4鉬銻抗比色法測定全磷含量，NaHCO3浸提法測定速效磷含量，乙酸銨浸提法測定速效鉀含量[10-11]。

　　1.4 土壤DNA提取

　　采用的是DNA試劑盒(MoBio PowerSoil DNA Isolation Kit)提取土壤樣品總DNA。DNA片段大小用濃度為1.0%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測[11-13]。

　　1.5 Illumina HiSeq測序及數據分析

　　本研究選取細菌的16S rRNA V4區基因片段進行檢測，引物為515F/806R(5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′/5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)。聚合酶鏈式反應(PCR)體系如下：15 μL 高保真聚合酶(New England Biolabs生產)、0.2 μmol/L正反引物、10 ng DNA模板[11，13]。PCR產物檢測回收后進行后續分析。

　　高通量測序由上海生工Illumina HiSeq 2500平臺運行，所測目標片段長度為250～300 bp[11-13]。原始數據(Tags數據)經所測得原始序列截去條形碼序列和引物序列后，經FLASH(V1.2.7)拼接獲得。通過軟件QIIME處理過濾原始數據獲得高質量Tags數據，并與數據庫進行比對檢測嵌合體序列，獲得有效數據。對有效序列進行聚類分析，利用RDP classifier(v2.2)軟件[12-16]與Greengenes數據庫進行物種注釋，以獲得土壤樣品中細菌群落的多樣性信息。

　　土壤微生物主要進行的是定性分析，即土壤微生物多樣性指數分析、微生物群落在門水平的變化分析、微生物群落在屬水平的變化分析、聚類分析、微生物群落在門水平相對豐度與土壤環境因子的冗余度排序分析(RDA)。微生物多樣性指數分析用來反映微生物群落的多樣性，指數越大表明群落的復雜程度也越高;可從門、屬水平來分析微生物群落構成差異。經過RDA可以檢測土壤環境、樣品、群落結構之間的關系。

　　1.6 數據處理

　　采用SPSS 25.0軟件進行差異顯著性分析;微生物群落在門、屬水平用物種豐度柱形堆積圖來表示，用R的gplots package軟件進行分析;微生物群落在門水平相對豐度與環境因子相關性分析，采用RDA法，所用軟件同上。

　　2 結果與分析

　　2.1 土壤理化性質

　　如表3所示，4個酒莊的土壤pH值為9.30～9.58，屬于典型的堿性土壤。各酒莊生產廢水灌溉土壤的pH值均略高于清水灌溉。除了銀色高地酒莊(YSGD)之外，其他3個酒莊廢水灌溉土壤與清水灌溉土壤pH值差異顯著(P<0.05)。除志輝源石酒莊(ZHYS)和沃爾豐(WEF)之外，其他2個采樣地廢水灌溉土壤電導率高于清水灌溉;其中，米擒(MQ)、銀色高地(YSGD)廢水灌溉區土壤電導率分別比清水灌溉高38.78%和7.87%。速效鉀含量在廢水灌溉土壤中均明顯低于清水灌溉區;其中，沃爾豐(WEF)、志輝源石(ZHYS)廢水灌溉土壤速效鉀含量分別顯著低于清水灌溉區23.53%和30.81%(P<0.05)。廢水灌溉區土壤速效磷含量均低于清水灌溉區;其中，沃爾豐(WEF)與志輝源石(ZHYS)廢水灌溉區速效磷含量分別低于對照組19.0%和5.8%。廢水灌溉的大部分土壤中全磷含量均低于清水灌溉區，其中志輝源石酒莊(ZHYS)廢水處理土壤全磷含量高于清水灌溉55.32%。米擒酒莊(MQ)與沃爾豐(WEF)酒莊廢水灌溉土壤有機質含量高于清水灌溉土壤31.29%和3.45%(P<0.05);在銀色高地(YSGD)和志輝源石(ZHYS)廢水灌溉土壤有機質含低于清水灌溉區，其中志輝源石酒莊(ZHYS)與CK土壤有機質含量差異顯著。米擒酒莊(MQ)廢水灌溉土壤堿解氮含量最高，為17.03 mg/kg，高于對照組73.78%，其他3個酒莊土壤堿解氮含量差異不顯著。

　　2.2 土壤細菌多樣本聚類分析

　　在聚類分析中，樣本之間的距離以樹枝長度表示，當樣本聚集到一起時其相似度越高。如圖1所示，將相似性標準值定位0.8，樣本可分成2類：一類是米擒酒莊(MQ、MQ_CK)，另一類是志輝源石、沃爾豐、銀色高地酒莊(ZHYS_CK、ZHYS、WEF_CK、WEF、YSGD_CK、YSGD)。廢水灌溉與清水灌溉使得銀色高地酒莊(YSGD、YSGD_CK)土壤細菌群落結構的差異較大，其他酒莊的2種水灌溉對土壤細菌群落影響較小。

　　2.3 土壤微生物多樣性指數

　　微生物群落多樣性指標包括香農指數(Shannon)、Chaol、辛普森指數(Simpson)及分類操作單元(OTU)，常被用于評價土壤微生物功能多樣性，它們的指數越高，表明樣品中的物種多樣性程度越高。如表4所示，OTU數目在米擒酒莊(MQ)廢水灌溉處理中最低;在志輝源石酒莊(ZHYS)廢水灌溉的土壤中OTU數目顯著少于清水灌溉處理。在米擒(MQ)和志輝源石酒莊(ZHYS)土壤廢水灌溉處理中Shannon指數低于清水灌溉，且在米擒酒莊(MQ)廢水灌溉的土壤細菌群落多樣性最低。在米擒(MQ)和志輝源石(ZHYS)酒莊土壤廢水灌溉處理中Chao1指數低于清水灌溉，且在米擒酒莊(MQ)用廢水灌溉的土壤細菌群落多樣性最低;Simpson指數在米擒酒莊(MQ)廢水灌溉土壤中達到最大值，在WEF、YSGT采樣地Simpson指數與CK沒有顯著差異。

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