摘要：[目的]分析鐵皮石斛Dendrobium officinale黃酮類化合物的生物合成途徑及相關基因，為鐵皮石斛黃酮類化合物代謝調控、藥用價值的開發研究提供參考。[方法]利用IlluminaHiSeq4000測序平臺對鐵皮石斛2個生長階段莖、葉進行高通量轉錄組測序，對組裝獲得的unigenes進行功能注釋和黃酮類化合物的生物合成相關基因解析。[結果]鐵皮石斛黃酮類化合物代謝相關Unigenes48個，涉及14個酶。5個CHS相關Unigenes具有CHS-like保守結構域，活性位點氨基酸殘基(Cys-His-Asn)高度保守，丙二酰輔酶A結合位點和產物結合位點的部分氨基酸殘基發生變異。CHl(Unigene0013781)屬于類型I查爾酮異構酶，異構化6'-羥基查爾酮為5-羥基黃烷酮。表達分析表明，2個生長時期的莖和葉，CHS(Unigene0008250)、CHI(Unigene0013781)和F3H的表達量都高于CHS(Unigene0012884)和C3'H。[結論]通過對轉錄組數據分析，共獲得鐵皮石斛黃酮類化合物代謝相關Unigenes48個，涉及14個酶;5個CHS相關Unigenes中，2個編碼查爾酮合酶，3個編碼聯芐合酶;CHl(Unigene0013781)屬于類型I查爾酮異構酶。

　　關鍵詞：鐵皮石斛;轉錄組;黃酮;功能注釋;表達;代謝

　　《分子細胞生物學報》(雙月刊)(Journal of Molecular Cell Biology)創刊于1936年,原名(中國實驗生物學雜志)。

　　0引言

　　(研究意義)黃酮類化合物是鐵皮石斛活性成分之一，通過分析鐵皮石斛高通量轉錄組測序數據，發掘黃酮類化合物代謝相關基因，分析代謝途徑，對鐵皮石斛黃酮類化合物的代謝調控和藥用價值的開發具有重要意義。(前人研究進展)黃酮類化合物屬于一類低分子多酚化合物，又稱黃酮體、黃堿素，是一類重要次生代謝產物，核心結構是由15個碳原子組成的2-苯基色原酮，具有C6-C3-C6基本骨架，由2個苯環(A環和B環)通過中央3個碳原子相連。目前已經發現并鑒定的黃酮類化合物有9000多種，可分為查爾酮類、黃酮和黃酮醇類、黃烷酮和黃烷醇類、異黃酮類等。

　　黃酮類化合物具有抗氧化、抗癌、降脂降糖、抗心肌缺血等功能。鐵皮石斛Dendrobium officinale是中國傳統名貴中藥材，具有抗氧化、增強機體免疫力、降血壓血脂、抗腫瘤等生理活性。黃酮類化合物是鐵皮石斛活性成分之一，不同部位、不同栽培方式和時間，總黃酮含量存在差異。徐麗紅等比較了不同栽培方式鐵皮石斛黃酮含量(以干基計)，最高的是純野生栽培，為0.25%，最低的是大棚仿野生栽培，為0.09%。唐麗等比較了不同生長齡鐵皮石斛葉、莖的總黃酮含量，0.5年生長齡植株莖、葉的總黃酮分別為0.035%和0.104%，高于其他生長齡。

　　黃秀紅等研究結果表明：鐵皮石斛盛花期、花苞期和微花期花的總黃酮含量分別為1.66%、1.52%和1.41%，差異顯著。鐵皮石斛花總黃酮對羥自由基、DPPH自由基和ABTS自由基都具有較強的清除能力，質量濃度為10mg·mL-1時，對DPPH和羥基自由基的清除率分別為89.77%和80.01%，花總黃酮對DPPH自由基、ABTS自由基和超氧陰離子的清除率效果比莖黃酮佳。黃酮類化合物與糖形成苷或以游離苷元形式存在。已經從鐵皮石斛中分離到的黃酮苷化合物有新西蘭牡荊苷Ⅱ、蘆丁、新西蘭牡荊苷Ⅰ、佛萊心苷、異佛萊心苷、夏佛塔苷和異夏佛塔苷等，新西蘭牡荊苷Ⅱ是不同道地種源鐵皮石斛共性黃酮苷，能有效抑制人肝癌HepG2細胞增殖，濃度50.35uml·L-1，給藥48h，細胞存活率為50.89%，可能通過調控MAPK信號通路和Bax/Bcl-2，Caspase途徑誘導細胞發生凋亡。

　　高通量轉錄組測序技術可以全面分析轉錄本，有利于分析次生代謝產物合成途徑，挖掘關鍵酶基因。馬婧等對草麻黃高通量轉錄組數據進行分析，獲得類黃酮代謝相關基因70個。鄒毅輝等對半枝蓮進行了轉錄組測序，獲得注釋unigenes 74185個，與黃酮類生物合成途徑相關89個，其中差異表達36個。鄒福賢等對不同種植時期的金線蓮進行轉錄組測序，獲得51370個unigenes，黃酮類生物合成代謝通路中，22個基因(6種酶)表達量差異顯著。(本研究切入點)利用轉錄組測序技術，可以發掘鐵皮石斛黃酮類化合物代謝相關基因，了解代謝途徑，但目前尚未見到相關報道。(擬解決的關鍵問題)本研究通過分析鐵皮石斛2個生長階段莖、葉的高通量轉錄組數據，發掘黃酮類化合物代謝相關基因，分析代謝途徑，解析CHS和CHI相關的unigenes，分析部分關鍵酶基因的表達，旨在為鐵皮石斛黃酮類化合物代謝調控、藥用價值的開發研究提供參考依據。

　　1材料與方法

　　1.1試驗材料與轉錄組數據組裝

　　鐵皮石斛采自福建省龍巖市連城縣冠豸山，經過莖段擴繁后，種植于福建省農業科學院亞熱帶農業研究所資源圃，于生長期(2016年8月15日)和成熟期(2016年12月15日)隨機采集3株新鮮莖、葉樣品供轉錄組測序，分別標記為T1(生長期莖)、T2(生長期葉)、T3(成熟期莖)、T4(成熟期葉)。轉錄組測序、數據的拼接、組裝和功能注釋由廣州基迪奧生物科技有限公司完成，測序平臺為Illumina HiSeq 4000。

　　1.2黃酮類相關Unigenes分析

　　為了獲得與黃酮類化合物代謝相關的基因信息，根據KEGG注釋信息進一步獲得Unigenes的Pathway注釋，分析黃酮類化合物代謝通路及相關unigenes。采用NCBI的BLAST X和BLAST P搜索序列相似性和氨基酸保守結構域。氨基酸序列的多重比對由軟件DNAMAN V6.0完成。采用MEGA6.0軟件NJ法進行分子進化樹分析。

　　1.3黃酮類合成關鍵酶基因表達分析

　　利用RPKM(Reads Per kb per Million reads)法計算Unigene表達量，分析關鍵酶基因的表達。RPKM法計算公式為：RPKM=(1000000×C)/(N×L/1000)。其中，設RPKM為Unigene A的表達量，C為比對到Unigene A的reads數，N為比對到所有Unigene的總reads數，L為UnigeneA的堿基數。

　　2結果與分析

　　2.1黃酮類化合物代謝途徑解析

　　4個樣品的原始數據(NCBI SRA號：SRPl81716)經過拼接、組裝后共獲得43085條Unigenes，KEGG數據庫注釋的有8972條。通過KEGG代謝途徑分析，共獲得48個黃酮類化合物代謝相關Unigenes，涉及14個酶(表1)，根據Pathway分析的代謝通路結合鐵皮石斛已經報道的黃酮類成分，推測黃酮類化合物生物合成途徑見圖1。首先，通過苯丙烷代謝途徑，在PAL、4CL和C4H的連續催化下，把苯丙氨酸轉化成黃酮類化合物代謝的起始底物對香豆酰輔酶A;PAL是苯丙烷代謝的第一個反應酶、限速酶，與PAL相關的Unigenes 4個。對香豆酰輔酶A接下去的反應有2條支路：一條是在HCT、C3'H和CCoAOM了等酶的催化下形成咖啡酰輔酶A和阿魏酰輔酶A，再經過CHS的催化形成2'，3，4，4’，6'五羥基查爾酮和4，2'，4'，6'四羥基-3-甲氧基查爾酮;另一條是在CHS的催化下，形成柚皮素查爾酮，CHS是苯丙烷代謝流向黃酮類代謝的第一個關鍵酶，相關的Unigenes 5個。柚皮素查爾酮經CHI異構化形成黃烷酮類化合物柚皮素，CHI相關的Unigenes2個。柚皮素在F3H、F3'H、F3'5'H、FLS等酶催化下形成二氫黃酮醇和黃酮醇類物質。二氫黃酮醇在DFR和LDOX等酶的催化，形成花色素。

　　2.2CHS相關Unigene生物信息學分析

　　KEGG代謝途徑分析與CHS相關的5個Unigene為Unigene0008250、Unigene0012884、Unigene0023486、Unigene0023487和Unigene0023488。利用DNAMANV6.0軟件預測Unigene的開放閱讀框(ORF)和比對氨基酸同源性，Unigene0008250、Unigene0012884、Unigene0023487和Unigene0023488含有完整的ORF，分別編碼395、390、390和390個氨基酸，同源性80.18%(圖2);Unigene0023486含部分的ORF，編碼148個完成氨基酸。采用NCBI的BLAST P搜索氨基酸序列相似性和保守結構域，Unigene0008250、Unigene0012884分別與金釵石斛(Dendrobium nobile)的查爾酮合酶(ABE77392.2)、海棗(Phoenixdactylifera)的查爾酮合酶(XP_008797107.1)同源性最高，為99%和88%。

　　Unigene0023487和Unigene0023488與姬蝴蝶蘭(Phalaenopsis equestris)的聯芐合酶(XP 020572026.1)分別具有87%和93%的同源性;Unigene0023486與蝴蝶蘭(Phalaenopsis Jp.)的聯芐合酶(P53416)具有96%的同源性。4個含有完整ORF的Unigenes都具有CHS-like保守結構域，含有3個活性位點，5個丙二酰輔酶A結合位點和6個產物結合位點。從圖2可以看出，3個活性位點的氨基酸殘基是保守的，但是，位點ii的N端相鄰兩個氨基酸殘基發生變異，Unigene0008250和Unigene0012884是IA，Unigene0023487和Unigene0023488是VP。5個丙二酰輔酶A結合位點中，位點1和3的氨基酸殘基保守;位點2和5的氨基酸殘基，Unigene0008250和Unigene0012884為RM和GPA，而Unigene0023487和Unigene0023488為RJ和GRA;位點4的氨基酸殘基Unigene0008250和Unigene0012884為F、Unigene0023487為P、Unigene0023488為A。6個產物結合位點只有e和f位點保守，b、c、d位點的氨基酸殘基Unigene0008250和Unigene0012884為G、IDG、T，Unigene0023487和Unigene0023488則為A、IGG、L;a位點的氨基酸殘基Unigene0008250和Unigene0012884為EIT，Unigene0023487為ETS、Unigene0023488為ETT。

　　2.3CHI相關Unigene生物信息學分析

　　KEGG代謝途徑分析與CHI相關的2個Unigenes為Unigene0013780和Unigene0013781。Unigene0013780帶有部分ORF，編碼89個氨基酸，Unigene0013781帶有完整的ORF，編碼244個氨基酸，氨基酸同源性比對發現，Unigene0013780編碼的89個氨基酸與Unigene0013781編碼的一段氨基酸一致性100%。通過NCBI的BLAST P搜索氨基酸序列相似性和保守結構域，Unigene0013781編碼的氨基酸屬于Chalcone_3superfamily，具有查爾酮.黃烷酮異構酶保守結構域，能夠異構化查爾酮形成柚皮素(4'，5，7.三羥基黃酮)，與姬蝴蝶蘭(Phalaenopsis equestris)的查爾酮-黃烷酮異構酶(XP 020583376)同源性為76%。采用MEGA6.0軟件將Unigene0013781編碼的氨基酸序列與來自其他物種的9個查爾酮-黃烷酮異構酶進行NJ聚類分析(圖3)，聚類結果把10個查爾酮-黃烷酮異構酶分為2類，日本百脈根(Lotusjaponicus)的BAC53983和BAC54038聚為一類，Unigene0013781同其他7個聚為一類，與姬蝴蝶蘭(Phalaenopsis equestris)的查爾酮-黃烷酮異構酶(XP 020583376)親緣關系最近。