摘 要：為了解魚糜加工副產物(魚頭、魚骨、魚鱗、魚鰭等)酶解物的添加對凍融鰱魚魚糜品質及凝膠特性的影響，對酶解物的體外抗氧化性及反復凍融魚糜的鹽溶性蛋白含量、巰基含量、Ca2+-ATP酶活性、表面疏水性、凝膠特性、凝膠持水性及色澤進行研究。結果表明：與其他酶相比，經胰蛋白酶及堿性蛋白酶酶解后，魚糜加工副產物酶解物的體外抗氧化活性最強;與對照組及蔗糖添加組魚糜相比，魚糜加工副產物酶解物的添加能夠有效減緩反復凍融后魚糜肌原纖維蛋白的冷凍變性及氧化速率，魚糜的鹽溶性蛋白含量、巰基含量、Ca2+-ATP酶活性較高，表面疏水性較低;同時，魚糜加工副產物酶解物的加入增強了魚糜凝膠的初始凝膠特性及持水性，并能夠有效延緩魚糜凝膠破斷力、凹陷度及凝膠強度的劣變，改善魚糜凝膠的持水性。

　　關鍵詞：魚糜加工副產物;酶解物;魚糜品質;反復凍融;凝膠特性

　　推薦閱讀：《肉類研究》Meat Research(月刊)1987年創刊，是面向國外公開發行的行業科技期刊，全面報道肉類加工領域科技成果和行業資訊，是肉類行業科研人員、管理人員的最愛讀本。

　　魚糜是魚肉肌原纖維蛋白的加工產物，因其良好的口感與營養價值深受消費者喜愛[1]。傳統的魚糜制品加工以海洋魚類為原料，但由于近年來海洋漁業資源的匱乏以及淡水魚養殖業的迅速發展，以淡水魚為原料的魚糜制品開發與研究得到廣泛關注[2-3]。鰱魚，又稱白鰱、水鰱等，2016年世界總產量約為530 萬t，在世界魚類產量中排名第2位[4]。鰱魚由于具有產量高、價格低廉及營養豐富等特點，被視為良好的魚糜加工替代品[5]。魚糜加工通常以魚肉為原料，約50%～60%的副產物，如魚頭、魚骨、魚鱗、魚鰭等往往被棄去，造成大量的資源浪費和環境污染問題[6]。這些副產物作為廉價且優質的蛋白質來源，可以通過酶解等生物技術進行深加工，得到的蛋白質酶解物能夠添加至魚糜中，改善魚糜制品的品質和營養價值[7-9]。因此，魚糜加工副產物酶解物的開發具有良好的研究價值和發展前景。

　　為延緩肌原纖維蛋白的降解及氧化，魚糜的貯藏一般以凍藏為主，然而由于冷鏈監控的不健全及魚糜貯運等環節的溫度波動，魚糜極易發生多次凍融循環，最終影響魚糜的品質及凝膠形成能力[10-11]，因此，如何控制魚糜在凍藏及凍融過程中的品質劣變是當今的研究熱點之一。目前的研究主要關注植物源的抗凍及抗氧化劑開發，如魔芋葡甘聚糖[12]、蘋果多酚[13]等已被證實具有減緩水產品蛋白質冷凍變性及抑制蛋白質氧化的效果;通過生物酶解技術得到動物源蛋白質酶解物，如太平洋無須鱈魚肌肉酶解物[14]、歐洲鰉魚魚皮酶解物[15]等同樣具有抗凍及抗氧化作用，然而，淡水魚中相關研究很少[7]。本研究以鰱魚魚糜加工副產物(魚頭、魚骨、魚鱗、魚鰭等)為研究對象，通過酶解技術(堿性蛋白酶、胰蛋白酶)制得魚糜加工副產物酶解物，探討酶解物的體外抗氧化活性(1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)自由基清除能力、亞鐵離子螯合能力)并將酶解物加入魚糜中，了解酶解物對反復凍融魚糜的蛋白質降解、氧化、凝膠形成能力、持水性等的影響，以期為魚糜加工副產物的高值化利用及魚糜制品的品質控制技術提供有效思路。

　　1 材料與方法

　　1.1 材料與試劑

　　36 條新鮮鰱魚(體長(55.05±1.15) cm，體質量(1 947±90) g)購于北京健翔橋水產市場。

　　胰蛋白酶(205 000 U/g)、堿性蛋白酶(280 000 U/g)、胃蛋白酶(42 500 U/g)、木瓜蛋白酶(245 000 U/g)、中性蛋白酶(135 000 U/g)及風味蛋白酶(26 000 U/g) 丹麥Novozymes公司;DPPH、啡啰嗪 美國Sigma公司;其余試劑購于北京化學試劑公司;所有試劑均為分析純。

　　1.2 儀器與設備

　　UV-2600紫外-可見分光光度計 尤尼柯(上海)儀器有限公司;T18高速分散均質機 美國IKA公司;CT-3質構儀 美國Brookfield公司;KDY-9820半自動凱氏定氮儀 北京通潤源機電儀器設備公司。

　　1.3 方法

　　1.3.1 鰱魚預處理

　　鰱魚經敲擊頭部致暈后，去鱗、頭、內臟，取魚片清洗后備用。魚頭、魚骨(含部分魚肉)、魚尾、魚鱗、魚皮等魚糜加工副產物收集后斬成小塊，置于-20 ℃冰箱備用。

　　1.3.2 魚糜加工副產物酶解物的制備

　　鰱魚魚糜加工副產物稱質量后，加入4 倍體積的蒸餾水，于121 ℃條件下加熱2 h提取蛋白質。待蛋白質提取液冷卻至室溫后過3 層濾網，收集上清液旋蒸濃縮后凍干，凍干粉的蛋白質含量采用凱氏定氮法測定[16]。將已知蛋白質含量的凍干粉與去離子水混合(1∶20，m/V)，調節底物溶液溫度及pH值至蛋白酶最適條件后，添加質量分數2%的蛋白酶進行酶解，酶解1 h后取上清液90 ℃加熱20 min滅酶、離心(5 000 r/min，15 min)后收集上清液并冷凍干燥，得到的粉末即為魚糜加工副產物酶解物。實驗前期對6 種鰱魚魚糜加工副產物酶解物(所用酶分別為胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、風味蛋白酶、中性蛋白酶及堿性蛋白酶)的抗氧化活性進行測定，最終選擇抗氧化性最強的2 種酶解物：胰蛋白酶及堿性蛋白酶酶解物添加至魚糜中。

　　1.3.3 魚糜加工副產物酶解物抗氧化活性測定

　　DPPH自由基清除能力及亞鐵離子螯合能力的測定參考Li Xue等[17]的方法。

　　1.3.4 魚糜制備及凍融循環

　　魚糜的制備參考Zhang Longteng等[5]的方法并稍作改動。取魚片上的魚肉并絞碎，稱質量后加入4 倍體積的冷卻蒸餾水(4 ℃)，于低溫條件下攪拌1 h進行第1次漂洗，漂洗時間為30 min;第2次漂洗將漂洗液更換為3 g/L氯化鈉溶液，漂洗液體積和漂洗時間與第1次相同。漂洗后，利用3 層80 目篩網過濾漂洗液，取濾網上層魚糜，通過擠壓魚糜調整其水分含量至78%，分裝。CK組魚糜不添加抗凍劑;S組魚糜添加質量分數4%的蔗糖;TS及AS組魚糜分別將體外抗氧化性最好的魚糜加工副產物胰蛋白酶及堿性蛋白酶酶解物添加至魚糜中部分替代蔗糖(TS組：2%魚糜加工副產物胰蛋白酶酶解物+2%蔗糖;AS組：2%魚糜加工副產物堿性蛋白酶酶解物+2%蔗糖)。所有組別魚糜置于-18 ℃條件下凍藏，每隔1 周凍融1 次(置于4 ℃冰箱至中心溫度達到4 ℃)，共凍融6 次，取凍融第0、2、4、6次的魚糜進行各項指標測定。

　　1.3.5 魚糜肌原纖維蛋白提取及鹽溶性蛋白含量測定

　　1.4 數據處理

　　實驗數據均為3 次平行測定的平均值±標準差，采用Excel 2013軟件進行數據處理，Origin 9.0軟件作圖，采用SPSS 18.0軟件進行單因素方差分析，差異顯著性水平為P<0.05。

　　2 結果與分析

　　2.1 魚糜加工副產物酶解物的抗氧化活性

　　脂質及蛋白質氧化是引起肉類貯藏與加工過程中品質及營養特性劣變的重要因素，過渡金屬離子(Fe2+、Cu2+等)及活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)是引發肉類制品氧化反應的必要條件[21]。

　　由表1可知：魚糜加工副產物胃蛋白酶酶解物的抗氧化活性最弱;與木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、風味蛋白酶相比，經堿性蛋白酶及胰蛋白酶處理的魚糜加工副產物酶解物具有良好的體外抗氧化活性，堿性蛋白酶酶解物的DPPH自由基清除率最高，達60.41%，而胰蛋白酶酶解物的亞鐵離子螯合率最大(93.82%)，表明2 種酶解物均能夠通過打斷自由基的鏈式反應及螯合過渡金屬離子，從而有效抑制氧化反應。通過生物酶解技術，一些疏水性氨基酸，如苯丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸等從天然蛋白質中暴露出來，它們能夠作為質子供體終止自由基傳遞，打斷氧化反應;酸性或堿性氨基酸，如谷氨酸、賴氨酸等則通過螯合過渡金屬離子起到抗氧化作用[22]。Wiriyaphan等[23]同樣發現，金線魚魚糜加工副

　　產物酶解物(所用酶為堿性蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶及Virgibacillus sp. SK33蛋白酶)具有清除自由基及螯合金屬離子的抗氧化作用。

　　2.2 魚糜加工副產物酶解物對反復凍融魚糜鹽溶性蛋白含量的影響

　　魚肉的蛋白質主要由水溶性肌漿蛋白、鹽溶性肌原纖維蛋白及不溶性肌基質蛋白組成，其中肌原纖維蛋白占魚肉蛋白質含量的50%～60%，是決定魚糜制品品質和加工特性的最重要蛋白質[24]。

　　由圖1可知，各組魚糜的鹽溶性蛋白含量初始值約為140 mg/g。隨著凍融次數的增加，各組魚糜的鹽溶性蛋白含量呈現不斷降低的趨勢，凍融6 次后，CK組魚糜鹽溶性蛋白含量僅為38.76 mg/g，與初始值相比下降約73.76%。魚糜凍融過程中因冰晶生成導致蛋白質空間結構的變化及疏水性氨基酸暴露，加速了蛋白質之間的氧化交聯、變性聚集及蛋白質溶解性的降低，因此鹽溶性蛋白含量呈現下降趨勢[15，19]。4%蔗糖的添加有效抑制了肌原纖維蛋白的冷凍變性，與初始值相比，S組魚糜鹽溶性蛋白含量僅降低44.58%。與CK組相比，魚糜加工副產物胰蛋白酶及堿性蛋白酶酶解物的加入(TS、AS組)同樣減緩了肌原纖維蛋白冷凍變性的速率，凍融6 次后，鹽溶性蛋白含量分別為64.85、82.25 mg/g。魚糜加工副產物酶解物中的親水性氨基酸，如谷氨酸、賴氨酸等能夠通過與魚糜中水分以非共價鍵結合，減少冰晶的形成，從而阻礙蛋白質的冷凍變性進程。