摘要 [目的]了解槐豬和杜洛克豬背部皮下脂肪組織脂肪沉積的分子機(jī)制差異。[方法]對槐豬和杜洛克豬背部皮下脂肪組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析。[結(jié)果]槐豬和杜洛克豬分別獲得37 858 968和37 545 394條干凈讀段(clean reads)。槐豬和杜洛克豬分別預(yù)測到9 612和9 457可變剪接事件;兩豬種間共有709個差異表達(dá)基因，與杜洛克豬相比，槐豬有395個上調(diào)基因和314個下調(diào)基因。差異表達(dá)基因共歸類到46個GO條目中，其中細(xì)胞組分11個、分子功能12個及生物學(xué)過程23個;顯著富集的KEGG通路共計(jì)9個，其中含有與調(diào)節(jié)脂類代謝顯著相關(guān)通路，如胰島素信號通路和PPAR信號通路等。[結(jié)論]該研究可為今后研究脂肪沉積的遺傳機(jī)理提供科學(xué)依據(jù)。

　　關(guān)鍵詞 槐豬;杜洛克豬;背部皮下脂肪組織;差異表達(dá);轉(zhuǎn)錄組測序

　　脂肪沉積性狀是豬主要的經(jīng)濟(jì)性狀之一，且與經(jīng)濟(jì)價值緊密聯(lián)系。槐豬(Huai Pig)是福建省特色豬品種，早熟易肥，肉質(zhì)優(yōu)良，抗逆性強(qiáng)，但生長速度慢，瘦肉率低，是典型的脂肪型豬種，而西方現(xiàn)代豬種杜洛克豬(Duroc Pig)生長速度快，瘦肉率高，但肉質(zhì)和抗逆性相對較差，是典型的瘦肉型豬種。為了解槐豬和杜洛克豬皮下脂肪組織脂肪沉積的分子機(jī)制差異，筆者對這兩個豬種背部皮下脂肪進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測序，并進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。

　　1 材料與方法

　　1.1 試驗(yàn)材料與測序

　　選擇在相近飼養(yǎng)條件下同期飼養(yǎng)的190日齡槐豬和杜洛克豬各3頭，屠宰后分別取倒數(shù)第3～4根肋骨之間的背部皮下脂肪組織，置于液氮中貯存;采用TRIzol法提取各樣品的總RNA，并采用Nanodrop、Agilent 2100方法對RNA樣品的純度、濃度和完整性進(jìn)行檢測，將符合測序要求的槐豬和杜洛克豬的總RNA分別等量混合，形成2個總RNA池，送交北京百邁客生物科技有限公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序(RNAseq)。

　　1.2 數(shù)據(jù)整理和分析

　　1.2.1 原始數(shù)據(jù)去雜。

　　測序所獲得的原始序列數(shù)據(jù)均帶有一段3′接頭序列，并且含有少量低質(zhì)量序列以及各種雜質(zhì)成分，經(jīng)過數(shù)據(jù)處理得到可用的干凈讀段(clean reads)。 具體處理方法如下：去除3′接頭序列、去除空載讀長、去除低質(zhì)量讀段(含有未知堿基N的讀段)、去除長度過小或過大的讀段等[1]。

　　1.2.2 序列比對和基因表達(dá)量分析。

　　使用TopHat軟件將獲得的干凈讀段(clean reads)與豬參考基因組(Sus scrofa 10.2：ftp：//ftp.ensembl.org/pub/release75/fasta/sus_scrofa/)進(jìn)行比對，并對比對效率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)[2]。采用FPKM(fragments per kilobase of transcript per million fragments mapped)作為衡量轉(zhuǎn)錄本或基因表達(dá)水平的指標(biāo)[3]，F(xiàn)PKM計(jì)算公式如下：

　　FPKM=基因區(qū)的讀段數(shù)目×109基因長度×測序深度(1)

　　1.2.3 可變剪切預(yù)測。

　　使用Cufflinks軟件對基因原有的剪接模型進(jìn)行比較，進(jìn)行可變剪接事件(alternative splicing events)預(yù)測[3]。常見的可變剪接可分為6種類型：外顯子跳躍(exon skipping，ES)、內(nèi)含子保留(intron retention，IR)、第一個外顯子可變剪接(alternative first exon，AFE)、最后一個外顯子可變剪接(alternative last exon，ALE)、5′端可變剪接(alternative 5′ splice site，A5SS)、3′端可變剪接(alternative 3′ splice site，A3SS)[4-5]。

　　1.2.4 基因功能注釋及差異表達(dá)基因篩選。

　　使用BLASTX軟件將基因序列與Nr、SwissProt、GO、COG和KEGG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，獲得所有基因的注釋信息。使用R軟件的EBSeq包進(jìn)行基因差異表達(dá)分析[6]，以=|log2(FC)|≥1且FDR<0.01作為篩選差異基因的標(biāo)準(zhǔn)。其中，差異倍數(shù)(fold change，F(xiàn)C)表示兩樣品之間表達(dá)量的比值，錯誤發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate，F(xiàn)DR)是對差異顯著性P值進(jìn)行BenjaminiHochberg方法校正后得到的[7]。

　　1.2.5 GO功能分類。

　　使用Blast2GO軟件對差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能分類，參數(shù)e值≤10-5[8]，并使用WEGO軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)并繪圖。GO(gene ontology)數(shù)據(jù)庫能對基因、蛋白質(zhì)進(jìn)行描述，其包含3個本體：細(xì)胞組分(cellular component)、分子功能(molecular function)和生物學(xué)過程(biological process)。

　　1.2.6 KEGG通路顯著性富集分析。

　　以KEGG通路為單位，找出與整個基因組背景相比在差異表達(dá)基因中顯著性富集的通路，其計(jì)算公式如下：

　　P=1-∑m-1i=0

　　Mi

　　N-Mn-i

　　Nn

　　(2)

　　式中，N為所有基因中具有通路注釋的基因數(shù)目;n為具有通路注釋基因中差異表達(dá)基因的數(shù)目;M為所有基因中注釋為某特定通路的基因數(shù)目;m為注釋為某特定通路的差異表達(dá)基因數(shù)目。Q≤0.05的通路定義為在差異表達(dá)基因中顯著富集的通路(Q表示錯誤比例，Q=V/R，其中R代表所挑選的差異基因個數(shù)，V代表沒有差異表達(dá)的基因個數(shù)，即假陽性結(jié)果)[1]。

　　2 結(jié)果與分析

　　2.1 測序數(shù)據(jù)質(zhì)量評估

　　對槐豬和杜洛克豬背部皮下脂肪組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，獲得原始讀段數(shù)目分別為46 891 554和45 309 436條，原始讀段經(jīng)過去雜處理后，獲得的干凈讀段數(shù)分別為37 858 968和37 545 394 條，其中78.54%和82.08% 的干凈讀段(clean reads)比對上豬參考基因組，可以滿足后續(xù)分析的需要。

　　2.2 可變剪切預(yù)測

　　槐豬和杜洛克豬背部皮下脂肪組織分別預(yù)測到9 612和9 457可變剪接事件。由圖1可知，在6個常見的可變剪切類型中外顯子跳躍的數(shù)量最多。

　　2.3 差異表達(dá)基因篩選和注釋

　　對槐豬和杜洛克豬背部皮下脂肪組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，并進(jìn)行差異表達(dá)基因篩選。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩豬種共有709個差異表達(dá)基因，與杜洛克豬相比槐豬有395個上調(diào)基因和314個下調(diào)基因。各個數(shù)據(jù)庫注釋到的差異表達(dá)基因數(shù)目及所占比例如表1所示。

　　2.4 GO功能分類 由圖2可知，槐豬和杜洛克豬背部皮下脂肪組織的差異表達(dá)基因共歸類到46個GO條目中，其中細(xì)胞組分11個、分子功能12個及生物學(xué)過程23個。細(xì)胞組分中分類到較多基因的條目為cell part、cell和organelle，分別含540、540和394個基因;分子功能中的條目binding含450個基因;生物學(xué)過程中的條目cellular process、metabolic process和biological regulation分別含519、462和412個基因。

　　2.5 KEGG通路顯著性富集分析

　　槐豬和杜洛克豬背部皮

　　下脂肪組織之間的差異表達(dá)基因共顯著富集到9個KEGG通路，通路信息如表2所示。

　　3 討論

　　該研究對槐豬和杜洛克豬背部皮下脂肪組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，分別獲得了37 858 968和37 545 394條干凈讀段。陳偉[9]對萊蕪豬和大白豬背最長肌的轉(zhuǎn)錄組測序分別獲得40 498 476 和59 072 892條干凈讀段。Sodhi等[10]對濟(jì)州島本地豬和巴克夏豬的脂肪組織進(jìn)行了測序，分別獲得41 411 459 和40 308 452條干凈讀段。由此可見，對不同豬品種同一個組織測序所獲得的干凈讀段數(shù)目不同;對同一個豬品種的不同組織的測序所獲得的干凈讀段數(shù)目也不同，這可能是由于不同組織所行使的生理功能和所含的基因數(shù)目不同。

　　推薦閱讀：農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新論文文獻(xiàn)如何檢索