摘要 [目的]研究溴鼠靈對(duì)斑馬魚的生態(tài)毒性效應(yīng)。[方法] 在2 h內(nèi)將受精后6 d的斑馬魚幼魚暴露在不同濃度的溴鼠靈溶液中，計(jì)算溴鼠靈對(duì)斑馬魚幼魚的半數(shù)致死濃度，并記錄染毒后斑馬魚的運(yùn)動(dòng)軌跡。[結(jié)果] 2 h內(nèi)溴鼠靈對(duì)斑馬魚幼魚的半數(shù)致死濃度(LC50)可達(dá)13.51 mg/L，表明溴鼠靈對(duì)斑馬魚幼魚具有顯著的急性毒性作用。光暗交替環(huán)境刺激下，隨著溴鼠靈濃度的升高，對(duì)斑馬魚幼魚的平均運(yùn)動(dòng)速度、加速度的抑制作用愈加顯著。當(dāng)藥物濃度低于1.00 mg/L時(shí)，各試驗(yàn)組斑馬魚幼魚的運(yùn)動(dòng)行為均未出現(xiàn)異常，當(dāng)試驗(yàn)進(jìn)行至60 min，10.00、50.00和100.00 mg/L濃度組斑馬魚幼魚的運(yùn)動(dòng)能力顯著下降。隨著藥物濃度的升高，斑馬魚幼魚對(duì)強(qiáng)光刺激的應(yīng)激反應(yīng)受到顯著抑制，100.00 mg/L濃度組斑馬魚幼魚基本失去應(yīng)激能力。[結(jié)論] 溴鼠靈在2 h內(nèi)對(duì)斑馬魚幼魚具有顯著的急性毒性作用，能夠顯著抑制其運(yùn)動(dòng)行為。

　　關(guān)鍵詞 溴鼠靈;急性毒性;斑馬魚;運(yùn)動(dòng)行為

　　近年來(lái)，毒鼠強(qiáng)、氟乙酰胺等急性強(qiáng)效殺鼠劑逐漸被禁用，目前較常見的殺鼠劑主要是第二類抗凝血?dú)⑹髣Ｅc第一類抗凝血類殺鼠劑相比，第二代抗凝血?dú)⑹髣┑亩拘愿鼜?qiáng)，毒力持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，因此在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中得到了廣泛使用[1-2]。此類殺鼠劑的大量使用可能導(dǎo)致部分藥物殘留進(jìn)入土壤、水體等環(huán)境中，引發(fā)水資源污染、食品污染等一系列問(wèn)題，進(jìn)而危害水生生物甚至人類的生命健康[3]。以溴鼠靈為代表的第二代抗凝血類殺鼠劑對(duì)環(huán)境造成的污染問(wèn)題越來(lái)越嚴(yán)重，也逐漸引起人們的重視。茅海瓊等[4]首次研究溴鼠靈在水環(huán)境突發(fā)性污染事故中的痕量殘留，采用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)行檢測(cè)，其檢出限可達(dá)0.08 μg/L。宓捷波等[5]建立了蔬菜及水果中溴鼠靈高效液相色譜-質(zhì)譜分析方法，檢出限可達(dá)0.5 μg/kg。

　　溴鼠靈(brodifacoum)又稱大隆、溴鼠隆，是第二類抗凝血?dú)⑹髣┑牡湫痛恚彩悄壳皯?yīng)用最廣泛的殺鼠劑，其中文名稱為3-[3-(4′-溴聯(lián)苯-4-基)-1，2，3，4-四氫-1-萘

　　基]-4-羥基香豆素，屬于4-羥基香豆素類衍生物殺鼠劑[6]。與其他抗凝血類殺鼠劑作用機(jī)制類似，當(dāng)溴鼠靈進(jìn)入機(jī)體后，阻礙肝臟合成凝血酶原及一些凝血因子在肝臟的合成，造成各個(gè)臟器及黏膜大量出血而死亡[7-8]。由于使用不當(dāng)、誤食而引起的抗凝血類殺鼠劑的中毒事件屢見報(bào)道[9-10]，在國(guó)內(nèi)甚至出現(xiàn)了利用抗凝血類殺鼠劑進(jìn)行投毒的案件[11]。目前，針對(duì)溴鼠靈等抗凝血類殺鼠劑的研究主要集中在中毒案例的救治[12-13]、生物樣品中藥物的檢測(cè)等領(lǐng)域[3，14-15]，目前尚缺乏能在短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)對(duì)溴鼠靈等抗凝血類殺鼠劑的快速、有效且準(zhǔn)確的檢測(cè)方法。因此，有必要開發(fā)高效、快速、靈敏的針對(duì)溴鼠靈急性毒性檢測(cè)手段，為及時(shí)、有效地預(yù)防和預(yù)警此類事件提供必要的技術(shù)支持和數(shù)據(jù)支撐。

　　斑馬魚(Danio rerio)是近年來(lái)新興的模式動(dòng)物，其基因與人類具有80%以上的高度同源性，并且具有成本低、通量高、試驗(yàn)周期短、靈敏度高、毒性生理指標(biāo)豐富等優(yōu)點(diǎn)[16]，被國(guó)際經(jīng)濟(jì)合作組織(Organization for Economic Cooperation and Development，OECD)列為實(shí)驗(yàn)室測(cè)試的推薦實(shí)驗(yàn)物種。我國(guó)也出臺(tái)了《水質(zhì)物質(zhì)對(duì)淡水魚(斑馬魚)急性毒性測(cè)定方法》將斑馬魚應(yīng)用于水質(zhì)檢測(cè)。目前，國(guó)內(nèi)外越來(lái)越多的學(xué)者以斑馬魚為模型開展藥物篩選[17-18]、化合物毒性評(píng)估[19-20]、環(huán)境監(jiān)測(cè)[21-22]等領(lǐng)域的研究。Rihel等[23]首次利用斑馬魚模型的行為學(xué)參數(shù)實(shí)現(xiàn)了神經(jīng)毒性化合物的篩查，在對(duì)明暗交替環(huán)境刺激模式下的斑馬魚運(yùn)動(dòng)行為參數(shù)分析后，從5 648個(gè)化合物中篩選出對(duì)斑馬魚有神經(jīng)毒性的化合物547個(gè)。筆者以斑馬魚為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，研究2 h內(nèi)溴鼠靈暴露對(duì)斑馬魚幼魚的急性毒性以及溴鼠靈對(duì)斑馬魚幼魚運(yùn)動(dòng)行為的影響，建立短時(shí)間內(nèi)溴鼠靈斑馬魚的中毒模型，以期為短時(shí)間內(nèi)溴鼠靈毒性評(píng)估提供試驗(yàn)數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。

　　1 材料與方法

　　1.1 主要材料

　　試驗(yàn)所用的親代斑馬魚均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所國(guó)家斑馬魚資源中心，自繁的第一代用于試驗(yàn)，在自動(dòng)水循環(huán)養(yǎng)殖系統(tǒng)中進(jìn)行養(yǎng)殖，水環(huán)境電導(dǎo)率400～540 μS/cm，pH 7.0～7.6，水溫(28.0±0.5)℃。魚缸和過(guò)濾墊每周清理1次，去除糞便，飼養(yǎng)光周期控制光暗比為14∶10。每天10∶00和15∶00分別投喂鮮活豐年蝦餌料1次。

　　E3培養(yǎng)液的配制：分別稱取NaCl 17.2 g、KCl 0.76 g、CaCl2 2.91 g、MgSO4·7H2O 4.9 g，用雙蒸水溶解后配制成1 L的E3培養(yǎng)液。常用試劑購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，4 ℃ 下保存，14 d內(nèi)使用。溴鼠靈標(biāo)準(zhǔn)品由杭州市公安局刑事科學(xué)技術(shù)研究所提供。因溴鼠靈微溶于水，20 ℃時(shí)在水中的溶解度僅為10 mg/L。試驗(yàn)前，用二甲基亞砜(DMSO)將溴鼠靈配制成母液，逐級(jí)稀釋到所需試驗(yàn)濃度，暴露溶液均為現(xiàn)配現(xiàn)用，確保各濃度組DMSO最終體積分?jǐn)?shù)小于0.5%，對(duì)照組DMSO體積分?jǐn)?shù)為0.5%(經(jīng)預(yù)試驗(yàn)可知，當(dāng)DMSO體積分?jǐn)?shù)為0.5%以下的處理與空白組處理無(wú)顯著差異，對(duì)胚胎期斑馬魚的發(fā)育以及幼魚的運(yùn)動(dòng)行為均無(wú)影響)。

　　主要儀器設(shè)備有Lab Tower EDI純水系統(tǒng)(美國(guó)賽默飛世爾公司)、恒溫培養(yǎng)箱(上海龍躍儀器設(shè)備有限公司)、DanioVision行為觀測(cè)系統(tǒng)(荷蘭諾達(dá)思信息技術(shù)公司)、電子分析天平(德國(guó)賽多利斯公司)、ZW-H3000體式顯微鏡(中國(guó)深圳中微科創(chuàng)公司)等。

　　1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

　　試驗(yàn)前12 h，選擇6～12月齡的健康性成熟斑馬魚按照雌雄1∶2的比例放置在孵化盒中，用透明玻璃板將雌、雄斑馬魚分隔開，在黑暗安靜環(huán)境下放置14 h。次日早晨，將雌、雄斑馬魚中間隔板抽離并給予光照刺激，使雌、雄斑馬魚在光照刺激下進(jìn)行交配產(chǎn)卵，約0.5 h后收集受精卵。用 E3培養(yǎng)液沖洗受精卵2～3次去除雜質(zhì)，6 h后在體視顯微鏡下觀察去除未受精以及形態(tài)有缺陷的胚胎，挑選出正常發(fā)育的斑馬魚胚胎于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中控光培養(yǎng)用于試驗(yàn)。

　　1.3 急性毒性試驗(yàn)

　　參考國(guó)際經(jīng)濟(jì)合作組織(OECD)魚類急性水生毒性試驗(yàn)設(shè)計(jì)暴露試驗(yàn)，急性毒性試驗(yàn)采用6孔板，每孔內(nèi)放置30尾6日齡(6dpf)幼魚，每孔加注溴鼠靈溶液6 mL，溴鼠靈濃度設(shè)置為0.01、0.10、1.00、10.00、50.00、100.00 mg/L。加魚、加藥時(shí)間控制在10 min內(nèi)，試驗(yàn)開始后記錄2 h內(nèi)斑馬魚幼魚的死亡數(shù)量，根據(jù)試驗(yàn)需要可適當(dāng)調(diào)節(jié)濃度設(shè)置，以便于計(jì)算半數(shù)致死濃度(LC50)，拍照并記錄染毒后幼魚的形態(tài)變化。

　　1.4 運(yùn)動(dòng)行為試驗(yàn)

　　斑馬魚幼魚的運(yùn)動(dòng)行為學(xué)試驗(yàn)溴鼠靈濃度設(shè)置為0.01(Ⅰ)、0.10(Ⅱ)、1.00(Ⅲ)、10.00(Ⅳ)、50.00(Ⅴ)、100.00 mg/L(Ⅵ)，每個(gè)濃度組隨機(jī)選擇12尾6日齡斑馬魚幼魚放入96孔板中，每孔1尾，將96孔板置于斑馬魚行為觀測(cè)系統(tǒng)箱體內(nèi)。參考Mcgrath[24]報(bào)道的采用光暗交替刺激條件，系統(tǒng)設(shè)置10 min光照、10 min黑暗的明暗交替模式，循環(huán)6次，共記錄2 h內(nèi)斑馬魚幼魚的運(yùn)動(dòng)軌跡，受試魚在試驗(yàn)前適應(yīng)10 s。主要測(cè)試斑馬魚幼魚在2 h內(nèi)的自由運(yùn)動(dòng)行為。使用EthoVision XT 14軟件分別記錄各濃度組幼魚的運(yùn)動(dòng)軌跡，計(jì)算運(yùn)動(dòng)的總距離、平均速度、運(yùn)動(dòng)熱圖以及各濃度組藥物毒性起效時(shí)間、受強(qiáng)光刺激后的運(yùn)動(dòng)加速度等行為參數(shù)。

　　1.5 強(qiáng)光刺激應(yīng)激試驗(yàn)

　　藥物濃度設(shè)置、孔板選用及加藥方式均與斑馬魚運(yùn)動(dòng)行為試驗(yàn)設(shè)置一致。參考文獻(xiàn)[25]報(bào)道的強(qiáng)光刺激試驗(yàn)方法，并進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整：在斑馬魚幼魚染毒60 min 后開啟強(qiáng)光照射刺激，采集并記錄第59～61 min斑馬魚幼魚的運(yùn)動(dòng)速度和加速度。

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