摘 要：暗溫室是中華鱉(Pelodiscus sinensis)人工養(yǎng)殖的主要方式之一。為闡明中華鱉暗溫室養(yǎng)殖過程中高氮水體和低氮水體中微生物多樣性及其與環(huán)境因子的關(guān)系，在河北省鹿泉中華鱉暗溫室養(yǎng)殖池挑選了總氮濃度較高的池塘和總氮濃度較低的池塘進行了水體理化因子監(jiān)測和微生物多樣性對比分析。水體理化因子檢測結(jié)果顯示兩種水體的溫度均在30 ℃左右，pH值為7左右，符合中華鱉的養(yǎng)殖要求。兩種水體的溶解氧為0.25 mg/L左右。高氮水體的總氮、氨氮、亞硝態(tài)氮、硝態(tài)氮的濃度相較于低氮水體均比較高。高氮與低氮水體在各分類水平上的優(yōu)勢菌群均存在差異，低氮水體綠屈擾菌門(Chloroflexi)占據(jù)主要優(yōu)勢，而高氮水體中變形菌門(Proteobacteria)占主要優(yōu)勢，屬水平層次上低氮水體中的優(yōu)勢菌為束縛桿菌屬(Haliscomenobacter)、亞硝化單胞菌屬(Nitrosomonas)。高氮水體多核桿菌屬(Polynucleobacter)、亮桿菌屬(Leucobacter)占據(jù)優(yōu)勢地位，兩種水體物種豐富度及相似度存在差異。結(jié)果表明高氮與低氮水體不僅在總氮和無機氮濃度上差別較大，微生物多樣性也存在明顯差距，微生物區(qū)系不同可能是造成氮濃度差異的原因之一。

　　關(guān)鍵詞：中華鱉(Pelodiscus sinensis);微生物多樣性;暗溫室養(yǎng)殖;理化因子;環(huán)境調(diào)控

　　中華鱉口感鮮美，含有豐富的蛋白質(zhì)、維生素以及微量元素，是一種高蛋白低脂肪的食物原料，長期以來一直被視為珍品，市場需求高漲[1]。中華鱉現(xiàn)有養(yǎng)殖模式主要有日光棚集約化養(yǎng)殖、暗溫室高密度養(yǎng)殖、日光棚+暗溫室兩段式養(yǎng)殖、仿生態(tài)養(yǎng)殖等[2]。高密度的暗溫室養(yǎng)殖養(yǎng)殖密度大、產(chǎn)量高，優(yōu)點是光線較弱，中華鱉互相撕咬現(xiàn)象明顯減少，缺點是水體中殘餌和糞便積累，養(yǎng)殖水體污染嚴重，患病幾率增加。本實驗通過對河北省鹿泉中華鱉暗溫室高氮和低氮養(yǎng)殖水體進行水質(zhì)理化參數(shù)監(jiān)測和微生物多樣性分析，闡明水體環(huán)境參數(shù)和微生物區(qū)系組成，為改善養(yǎng)殖水體水質(zhì)特別是減少氮源污染，實現(xiàn)中華鱉健康養(yǎng)殖提供參考依據(jù)。

　　1 材料和方法

　　1.1 樣品采集

　　分別取中華鱉良種場暗溫室兩個池塘養(yǎng)殖水體樣品，總氮濃度較高的養(yǎng)殖池塘，記為H-N，總氮濃度較低的養(yǎng)殖池塘，記為L-N。分別在兩個池塘的左、中、右位置取水，每個池塘取3個水樣，用于水質(zhì)監(jiān)測和微生物多樣性分析。

　　1.2 水體理化因子分析

　　現(xiàn)場采樣過程中，采用YSI pH100A便攜式酸度計測定pH值，采用YSI DO200便攜式溶氧儀測定溶解氧濃度。水樣帶回實驗室測定總氮、氨氮、亞硝酸氮、硝酸氮等化學指標。總氮采用堿性過硫酸鉀消解-紫外分光光度法進行測定，氨氮采用納氏試劑-分光光度法進行測定，亞硝酸鹽采用N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法進行測定，硝酸鹽采用紫外分光光度法進行測定[3]。

　　1.3 水體微生物多樣性分析

　　1.3.1 樣品處理 過濾前靜置分離懸浮顆粒，用20 μm大孔徑濾膜預過濾一遍，再用0.22 μm微孔濾膜進行抽濾，水樣過濾之后，將微生物富集的濾膜裝在50 mL離心管中，在-80 ℃冰箱中保存。

　　1.3.2 DNA提取、PCR和高通量測序 水體微生物多樣性由上海派森諾生物科技股份有限公司進行測定。提取總DNA，采用NanoDrop 2000超微量分光光度計對DNA進行濃度和質(zhì)量檢測，設計簡并引物：520F：5’-barcode+AYTGGGYDTAAAGNG-3’， 802R： 5’-TACNVGGGTATCTAATCC-3’擴增細菌16S rRNA V4區(qū) (C，T = Y; G，A，T = D; A，C，G = V; A，C，G，T =N) 。PCR產(chǎn)物通過1.2%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，并進行磁珠純化回收。回收產(chǎn)物采用酶標儀Microplate reader(BioTek，F(xiàn)Lx800)測定濃度，所用試劑為Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit。根據(jù)測定的濃度，按照每個樣本的測序量需求，對各樣本按相應比例進行混合。采用Illumina公司的TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit制備測序文庫，最后上機進行高通量測序。

　　1.3.3 測序數(shù)據(jù)的篩查與處理 運用QIIME 2軟件切除序列的引物片段，棄去未匹配引物的序列。隨后，通過QIIME 2軟件調(diào)用DADA2進行質(zhì)控、去噪、拼接、去嵌合體序列獲取高質(zhì)量的數(shù)據(jù)。

　　1.3.4 物種分類學注釋 對于細菌或古菌的16S rRNA基因，默認選用Greengenes數(shù)據(jù)庫。對于每個ASVs的特征序列或每個OTU的代表序列，在QIIME2軟件中使用默認參數(shù)，使用預先訓練好的Naive Bayes分類器進物種注釋。

　　1.3.5 α-多樣性分析 多樣性是指局部均勻生境下的物種在豐富度(richness)、多樣性(diversity)和均勻度(evenness)等方面的指標[4]，也被稱為生境內(nèi)多樣性，反映的是單個樣品中的物種多樣性。采用香農(nóng)-威納多樣性指數(shù)(Shannon-Wiener diversity index)、辛普森多樣性指數(shù)(Simpson diversity index)、Chao1指數(shù)、Pielou均勻度指數(shù)(Pielou evenness index)和覆蓋率(Coverage)對6個樣品中微生物的α-多樣性進行比較和分析[5]。樣品中的群落多樣性用香農(nóng)-威納多樣性指數(shù)[6]和辛普森指數(shù)估算，樣品中的物種總數(shù)(OTU數(shù)目的指數(shù))用Chao1[7]算法估計，樣品中群落的均勻度用Pielou均勻度指數(shù)估算，用樣品文庫的覆蓋率[8]評價測序結(jié)果的真實性。

　　1.3.5 物種差異分析及標志物種 為了探究微生物群落組成上的差異(即β-多樣性)，了解微生物群的差異主要是由哪些物種的差異分布所導致的，借助ASV/OTU維恩圖、物種組成熱圖、LEfSe分析等方法來進行分析，進一步展示樣品間的物種差異。

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