【摘要】 目的 研究膽囊腺癌、癌旁組織、慢性膽囊炎組織中蛋白基因產(chǎn)物9.5(PGP9.5)表達(dá)及其臨床病理意義。方法 108例膽囊腺癌、46例癌旁組織和35例慢性膽囊炎切除標(biāo)本常規(guī)石蠟包埋切片，PGP9.5染色方法為EnVisionTM免疫組化法。結(jié)果 膽囊腺癌PGP9.5表達(dá)陽(yáng)性率(45.4%)和評(píng)分(1.94±1.84)明顯高于癌旁組織(17.4%，X2=10.83，P<0.01;0.86±1.41，t=3.60，P<0.01)和慢性膽囊炎組織(11.4%，X2=13.06，P<0.01;0.58±1.29，t=4.08，P<0.01);PGP9.5陽(yáng)性良性病變膽囊上皮均呈中至重度不典型增生。患者年齡≤45歲、腺瘤癌變或高分化腺癌、腫塊最大徑<2 cm、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和未侵犯周圍組織病例PGP9.5表達(dá)陽(yáng)性率及其評(píng)分明顯低于年齡>45歲、低分化腺癌、腫塊最大徑≥2 cm、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和侵犯周圍組織病例(P<0.05或P<0.01)。結(jié)論 PGP9.5表達(dá)可能是反映膽囊腺癌發(fā)生、進(jìn)展和預(yù)后的重要生物學(xué)標(biāo)志物，檢測(cè)膽囊良性病例PGP9.5表達(dá)水平對(duì)于預(yù)防和早期發(fā)現(xiàn)膽囊癌可能有重要臨床意義。

　　【關(guān)鍵詞】 膽囊腫瘤 慢性膽囊炎 蛋白基因產(chǎn)物9.5 免疫組織化學(xué)

　　Abstract Objective To study the expression of PGP9.5 and its clinicopathological significances in tissues of gallbladder adenocarcinoma， pericancerous tissues and chronic cholecystitis. Methods Immunohistochemical method was used for the detection of PGP9.5 expressive levels in routinely paraffin-embedded sections from the specimens of gallbladder adenocarcinoma (n=108)， pericancerous tissues (n=46) and chronic cholecystitis (n=35). Results The positive rates and scores of PGP9.5 in gallbladder adenocacrcinoma (45.4%， 1.94±1.84) were significantly higher than those in pericancerous tissues (17.4%， X2=10.83， P<0.01; 0.86±1.41， t=3.60， P<0.01) and chronic cholecysitis (11.4%， X2=13.06， P<0.01; 0.58±1.29， t=4.08， P<0.01). The positive rates and scores of PGP9.5 were significantly lower in the cases of aged ≤45 years， adenomatous canceration or high-differentiatied adenocarcinoma， maximal diameter of mass <2 cm， no-metastasis of lymphnode， and no-invasion of regional tissues than those in the ones of aged >45 years， low-differentiated adenocarcinoma， maximal diameter of mass ≥2 cm， metastasis of lymphnode and invasion of regional tissues. Conclusion The expressive levels of PGP9.5 may be an important marker for reflecting the carcinogenesis， progression， biological behaviors and prognosis of gallbladder adenocarcinoma. The assayes of PGP9.5 expressive levels in benign lesions of gallbladder may have important clinical values for the prevention and early-stage finding of gallbladder carcinoma.

　　Key words gallbladder neoplasms; chronic cholecystitis; protein gene product 9.5; immunohistochemistry 蛋白基因產(chǎn)物9.5(protein gene product 9.5， PGP9.5)是一種分子量為27KD的神經(jīng)元特異性蛋白質(zhì)，為神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤的標(biāo)志物。但新近發(fā)現(xiàn)PGP9.5不僅在神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤細(xì)胞表達(dá)，也可在其他上皮源性腫瘤細(xì)胞中表達(dá)，且其表達(dá)水平與上皮源性惡性腫瘤發(fā)生、進(jìn)展及預(yù)后有密切關(guān)系[1-6]。國(guó)內(nèi)外尚未見膽囊良惡性病變組織中PGP9.5表達(dá)研究的文獻(xiàn)報(bào)道。我們應(yīng)用EnVisionTM免疫組化方法研究膽囊腺癌、癌旁組織和慢性膽囊炎組織中PGP9.5表達(dá)水平及其臨床病理意義。

　　1 材料和方法

　　1.1 標(biāo)本及臨床病理資料 收集湘雅二醫(yī)院、湘雅醫(yī)院和湖南省人民醫(yī)院1996年6月至2006年6月間膽囊癌手術(shù)切除標(biāo)本108例，男性31例(28.7%)，女性77例(71.3%)。病理類型均為腺癌，其中腺瘤癌變9例(8.2%)，高分化腺癌29例(26.9%)，中分化腺癌29例(26.9%)，低分化腺癌30例(27.8%)，黏液腺癌11例(10.2%);術(shù)中發(fā)現(xiàn)侵犯膽囊外周圍組織器官59例(54.6%);共有59例發(fā)生區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(54.6%);58例伴有膽囊結(jié)石(53.7%);手術(shù)方式包括根治性切除34例(31.5%)，姑息手術(shù)48例(44.4%)和因廣泛轉(zhuǎn)移不能手術(shù)僅取轉(zhuǎn)移灶癌組織26例(24.1%)。從以上108例膽囊腺癌中選擇46例癌旁組織(距癌組織≥3 mm)，其中正常10例、輕度不典型增生10例，中度不典型增生12例和重度不典型增生14例。另收集35例慢性膽囊炎組織標(biāo)本(單純慢性膽囊炎15例、慢性膽囊炎伴膽囊結(jié)石20例)作為對(duì)照，其中正常膽囊黏膜11例、輕度不典型增生12例、中度不典型增生7例及重度不典型增生5例。以上標(biāo)本經(jīng)4%甲醛固定后常規(guī)制作石蠟包埋切片，切片厚4 ?滋m。

　　1.2 主要試劑 　兔抗人PGP9.5多克隆抗體購(gòu)自北京金橋中杉生物技術(shù)公司， EnVisionTM探查試劑盒(兔/鼠)購(gòu)自上海基因技術(shù)有限公司。

　　1.3 方法 　PGP9.5染色方法為EnvisionTM二步免疫組化法，主要步驟：切片脫蠟至水洗→3% H2O2甲醇液15 min→流水沖洗，0.125% EDTA抗原修復(fù)液15 min→流水沖洗，蒸餾水洗→滴加兔抗人PGP9.5多克隆抗體(1/100) 37℃ 60 min→0.01 mol/L PBS(pH7.4)洗3次×5 min→滴加A液37℃ 30 min→0.01 mol/L PBS液洗3次×5 min→滴加DAB顯色液15 min→流水沖洗→蘇木素液 1 min→流水返蘭15 min→脫水，透明、中性樹膠封固。細(xì)胞漿內(nèi)含棕黃色顆粒者為陽(yáng)性細(xì)胞，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：將切片中細(xì)胞漿著色強(qiáng)度評(píng)分(無，0分;弱， 1分;中，2分;強(qiáng)，3分)和切片中陽(yáng)性細(xì)胞率評(píng)分(≤5%，0分;6%～10%，1分;11%～20%，2分;21%～50%，3分;>50%，4分)之和為該切片評(píng)分值，將評(píng)分值≤2分定為陰性病例，≥3分定為陽(yáng)性病例。以北京金橋中杉生物技術(shù)公司提供的陽(yáng)性切片作為陽(yáng)性對(duì)照，以0.01 mol/L PBS液(pH7.4)替代一抗作為陰性對(duì)照。統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：將所得數(shù)據(jù)輸入至 SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件中進(jìn)行t檢驗(yàn)、F檢驗(yàn)或Fishers精確概率法，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

　　2 結(jié)果

　　2.1 PGP9.5在膽囊良惡性病變中表達(dá)情況 PGP9.5免疫組化反應(yīng)陽(yáng)性產(chǎn)物定位于胞漿(見圖1，2)。108例膽囊腺癌PGP9.5表達(dá)陽(yáng)性病例49例(45.4%)，其評(píng)分均值為1.94±1.84;46例癌旁組織PGP9.5陽(yáng)性8例(17.4%)，其評(píng)分均值為0.86±1.41;35例慢性膽囊炎PGP9.5陽(yáng)性病例為4例(11.4%)，其評(píng)分均值為0.58±1.29;PGP9.5表達(dá)陽(yáng)性的癌旁組織和慢性膽囊炎病例膽囊黏膜上皮均呈中至重度不典型增生。膽囊腺癌PGP9.5表達(dá)陽(yáng)性率及其評(píng)分均值明顯高于癌旁組織(X2=10.83，P<0.01;t=3.60，P<0.01)和慢性膽囊炎組織(X2=13.06，P<0.01;t=4.08，P<0.01)。

　　2.2 PGP9.5表達(dá)與膽囊腺癌臨床病理特征的關(guān)系

　　腺瘤癌變或高分化腺癌、腫塊最大徑<2 cm、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及未侵犯周圍組織病例PGP9.5表達(dá)陽(yáng)性率及其評(píng)分明顯低于低分化腺癌、腫塊最大徑≥2 cm、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及侵犯周圍組織病例(P<0.05或P<0.01)。見表1。

　　3 討論

　　PGP9.5是一個(gè)泛素水解酶，它廣泛表達(dá)于神經(jīng)元分化的各個(gè)階段，為神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的一個(gè)特定組織標(biāo)志物。當(dāng)前積累的資料顯示泛素羧基末端羥化酶家族在細(xì)胞的蛋白水解途徑中起調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和死亡的重要作用，蛋白去泛素化與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)及惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系近年來日漸引起關(guān)注。PGP9.5介導(dǎo)的針對(duì)細(xì)胞蛋白的泛素——蛋白酶體系統(tǒng)，可能是調(diào)節(jié)細(xì)胞周期基因的重要機(jī)制，通過引起細(xì)胞周期蛋白的去泛素化增加促進(jìn)未分化的體細(xì)胞無序生長(zhǎng)和繁殖，同時(shí)PGP9.5的表達(dá)可能誘導(dǎo)一些能影響細(xì)胞分裂周期的基因[1-6]。因此PGP9.5在調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白表達(dá)方面具有重要作用，從而與惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展及預(yù)后有重要關(guān)系。Hibi等[1]發(fā)現(xiàn)PGP9.5表達(dá)不僅與小細(xì)胞肺癌發(fā)生、進(jìn)展及預(yù)后有關(guān)，而且也與非小細(xì)胞肺癌發(fā)生、進(jìn)展及預(yù)后有密切關(guān)系，高表達(dá)者進(jìn)展快、易發(fā)生轉(zhuǎn)移、侵襲潛力強(qiáng)及預(yù)后差，認(rèn)為PGP9.5的表達(dá)是不依賴神經(jīng)分泌而獨(dú)立存在的和肺癌病理分期及預(yù)后相關(guān)的重要生物學(xué)指標(biāo)。此后，國(guó)外學(xué)者相繼研究了胃癌、食管癌、腸癌和甲狀腺髓樣癌PGP9.5表達(dá)及甲基化水平，均發(fā)現(xiàn)部分惡性腫瘤PGP9.5高表達(dá)，其表達(dá)水平及甲基化水平與惡性腫瘤發(fā)生、進(jìn)展、轉(zhuǎn)移、侵襲、臨床病理分期及預(yù)后密切相關(guān)，高表達(dá)者及高甲基化水平者進(jìn)展快、易發(fā)生轉(zhuǎn)移、侵襲潛力強(qiáng)、臨床病理分期高及預(yù)后差，而其相應(yīng)來源的正常組織及良性病變組織PGP9.5呈低表達(dá)或不表達(dá)[2-6]。

　　本組資料顯示，膽囊腺癌PGP9.5表達(dá)陽(yáng)性率及其評(píng)分明顯高于癌旁組織和慢性膽囊炎(P<0.01);PGP9.5陽(yáng)性表達(dá)的癌旁組織和慢性膽囊炎膽囊上皮均呈中至重度不典型增生;腺瘤癌變或高分化腺癌、腫塊最大徑<2 cm，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、未侵犯膽囊外周圍組織病例PGP9.5表達(dá)陽(yáng)性率及其評(píng)分明顯低于低分化腺癌、腫塊最大徑≥2 cm、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及侵犯周圍組織病例。其結(jié)果與國(guó)外學(xué)者在其他惡性腫瘤中的研究結(jié)果較一致，說明PGP9.5陽(yáng)性的膽囊腺癌可能進(jìn)展快、生長(zhǎng)速率高，易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及侵犯周圍組織器官，PGP9.5表達(dá)水平可能是評(píng)估膽囊腺癌進(jìn)展、生物學(xué)行為和預(yù)后的重要生物學(xué)標(biāo)志物，其作用機(jī)制可能與其調(diào)控細(xì)胞周期蛋白基因有關(guān)，但有待更深一步研究。

　　【參考文獻(xiàn)】

　　[1] Hibi K， Westra WH， Borges M， et al. PGP9.5 as a candidate tumor marker for non-small-cell lung cancer[J]. Am J Pathol，1999，155(3)：711-715.

　　[2] Yamashita K， Park HL， Kim MS， et al. PGP9.5 methylation in diffuse-type gastric cancer[J]. Cancer Res，2006，66(7)：3921-3927.

　　[3] Mandelker DL， Yamashita K， Tokumaru Y， et al. PGP9.5 promoter methylation is an independent prognostic factor for esophageal squamous cell carcinoma[J]. Cancer Res，2005，65(11)：4963-4968.

　　[4] Yamazaki T， Hibi K， Takase T， et al. PGP9.5 as a marker for invasive colorectal cancer[J]. Clin Cancer Res，2002，8(1)：192-195.

　　[5] Takano T， Miyauchi A， Matsuzuka F， et al. PGP9.5 mRNA could contribute to the molecular-based diagnosis of medullary thyroid carcinoma[J]. Eur J Cancer，2004，40(4)：614-618.

　　[6] Takase T， Hibi K， Yamazaki T， et al. PGP9.5 over expression in esophageal squamous cell carcinoma[J]. Hepatogastroenterology，2003，50(53)：1278-1280.