〔摘要〕 目的 從動情周期、骨密度、骨組織形態(tài)結(jié)構(gòu)和原代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells， BMMSCs)生長曲線4個層次判定雌性大鼠手術(shù)去勢造模是否成功。方法 30只2月齡SPF級雌性大鼠，隨機平均分為空白組、假手術(shù)組和模型組3組。手術(shù)去勢造模完成后次日起連續(xù)7 d對3組大鼠進(jìn)行陰道脫落細(xì)胞涂片，判斷動情周期。造模后第8天取左側(cè)股骨組織做骨密度測定和HE染色，取右側(cè)骨組織分離原代BMMSCs。結(jié)果 空白組和假手術(shù)組動情周期正常，模型組大鼠動情周期紊亂;骨組織HE染色顯示模型組骨小梁稀少且間距加大;與空白組比較，假手術(shù)組骨密度和BMMSCs生長速率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，與假手術(shù)組相比，模型組骨密度顯著降低，BMMSCs生長速率顯著下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)論 造模成功后的雌性大鼠動情周期紊亂，骨密度降低，骨小梁疏松，BMMSCs的生長緩慢，為骨質(zhì)疏松癥動物模型建立判定提供較全面的依據(jù)。

　　〔關(guān)鍵詞〕 去勢雌性大鼠;骨質(zhì)疏松癥;動物模型;動情周期;骨密度;骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞

　　根據(jù)國家統(tǒng)計局調(diào)查顯示[1]，我國65歲以上人口接近1.4億(約占總?cè)丝诘?0.1%)，是世界上老年人口絕對數(shù)最多的國家。有專家預(yù)測[2]，2050年我國用于治療原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥性骨折費用將達(dá)1 630億元。隨著人口老齡化趨勢的日益加重，骨質(zhì)疏松癥將成為我國重要的公共健康問題，因此，開展骨質(zhì)疏松癥研究具有較高的科學(xué)價值。目前，骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病機制尚不明確，在針對骨質(zhì)疏松癥發(fā)生機制開展的各種研究方法中，動物模型是目前較為常用的一種研究方法。造模方法中的手術(shù)去勢是指通過去除雌性大鼠雙側(cè)卵巢的方法造成雌激素水平急劇下降、骨量大量丟失，建立骨質(zhì)疏松癥模型，具有建模因素單一、建模成功率高、可重復(fù)性好、可信度高和能夠很好地體現(xiàn)雌激素水平下降這一重要病理生理現(xiàn)象等優(yōu)點[3]。本實驗采用雌性大鼠作為研究動物[4]，通過陰道脫落細(xì)胞涂片、股骨密度測定、骨組織形態(tài)和原代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。

　　marrow mesenchymal stem cells， BMMSCs)生長曲線4個層次的客觀指標(biāo)來判定造模是否成功[5]。

　　1 材料

　　1.1 動物

　　SPF級SD雌性大鼠，許可證號：SCXK(湘)2016-0002，體質(zhì)量190～250 g，6～8周齡，30只，購自湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司，于湖南中醫(yī)藥大學(xué)清潔級動物實驗中心飼養(yǎng)，實驗單位許可證號：SYXK(湘)2013-005。動物分籠飼養(yǎng)。環(huán)境溫度為(22±4) ℃，濕度為50%±10%，自由進(jìn)食進(jìn)水，飼料為標(biāo)準(zhǔn)普通飼料(湖南中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心提供)，并保持環(huán)境安靜，定時清掃鼠籠衛(wèi)生。實驗過程中對動物的處置符合實驗動物管理和使用委員會的要求，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)行試驗。

　　1.2 試劑

　　低糖DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)(美國Gibco公司，批號8657263);FBS胎牛血清(美國Gibco公司，批號42A0071K);雙抗(美國Gibco公司，批號1999384);Trypsin-EDTA(美國Gibco公司，批號1868583);PBS(美國Hyclone公司，批號AD1779227);CCK-8試劑盒(上海七海復(fù)泰生物科技有限公司，批號20190124);FITC anti-mo/rat CD29抗體(美國eBioscience公司，批號11-0291-80);FITC anti-rat CD90抗體(美國Biolegend公司，批號206105);CD34(美國Abcam公司，批號ab81289);CL488-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)(美國Proteintech公司，批號SA00013-2)等。

　　1.3 儀器

　　HR30-IIA2型生物安全柜(中國海爾集團公司);311型CO2培養(yǎng)箱(美國賽默飛世爾科技公司);AE2000型倒置顯微鏡(中國麥克奧迪實業(yè)集團公司);低速離心機(美國萊伯特公司);DCW-3510型恒溫水浴鍋(中國寧波新芝生物科技股份有限公司);全身雙能X線骨密度儀(北京中西遠(yuǎn)大科技有限公司);MIAS型醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)(成都泰盟軟件有限公司);Ni-U型研究型正置顯微鏡(日本株式會社尼康公司);A00-1-1102型流式細(xì)胞儀(美國貝克曼庫爾特有限公司)等。

　　2 方法

　　2.1 動物分組及造模

　　按照隨機數(shù)字表法將30只SPF級雌性大鼠分為空白組、假手術(shù)組和模型組3 組，每組10只。模型組采用去除雌性大鼠雙側(cè)卵巢方法建立絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥模型[5-6]，現(xiàn)配10%的水合氯醛溶液，濃度為3 mL/kg。假手術(shù)組和模型組大鼠腹腔注射水合氯醛溶液麻醉，俯臥位固定于大鼠板上，剃毛消毒后，沿第一胸腰椎兩側(cè)外1 cm處縱向切開皮膚肌肉，分離找到卵巢，結(jié)扎后完整摘除兩側(cè)卵巢，分兩層縫合切口，用無菌生理鹽水沖洗傷口，絡(luò)合碘消毒[7]。術(shù)后連續(xù)3 d在假手術(shù)組和造模組大鼠后腿肌肉內(nèi)側(cè)注射青霉素，每只4萬IU/d，6 d后拆線，空白組不做任何處理。

　　2.2 雌性大鼠陰道脫落細(xì)胞涂片

　　造模后第1天清晨10點，取空白組、假手術(shù)組和模型組3組大鼠，用小號無菌棉簽進(jìn)入大鼠陰道內(nèi)，輕輕旋轉(zhuǎn)棉簽后，將陰道分泌物涂抹在已經(jīng)滴加了少量生理鹽水的防脫玻片上(均勻平鋪即可)，待玻片自然風(fēng)干后進(jìn)行HE染色，1次/d，連續(xù)7 d。將7 d的玻片收集到一塊進(jìn)行HE染色。

　　2.3 骨密度測定和骨組織HE染色觀察微細(xì)結(jié)構(gòu)

　　造模后第8天，采用頸椎脫臼法處死所有動物。左側(cè)股骨組織用于骨密度測定和骨組織HE染色。每組5只雌性大鼠左后肢用濕紗布包裹，送至湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院實驗中心送檢，用Unigamma X-RAY Plus雙能X線骨密度儀檢測雌鼠左后肢股骨密度。每組另5只雌性大鼠左后肢去除毛發(fā)后固定在4%PFA中，在5%的硝酸中脫鈣7 d，進(jìn)行HE染色[8]，檢測股骨病理形態(tài)學(xué)變化。

　　2.4 BMMSCs的分離

　　造模后第8天，各組大鼠右側(cè)骨組織均用于提取BMMSCs。全骨髓貼壁法分離BMMSCs及傳代培養(yǎng)：清潔消毒操作區(qū)域，細(xì)胞房紫外消毒滅菌30 min，將大鼠右后肢在裝有醫(yī)用酒精的燒杯中浸泡2 min后剪去毛發(fā)及肌肉顯露骨組織，剪斷骨組織兩端骨骺露出骨髓腔，用預(yù)先配制好的DMEM完全培養(yǎng)液沖洗骨髓腔，將沖洗液收集在無菌15 mL BD管中，離心去上清，加完全培養(yǎng)基進(jìn)行重懸后，轉(zhuǎn)移至25 cm2培養(yǎng)瓶中，做好組別和P0代標(biāo)記。

　　2.5 BMMSCs的鑒定

　　細(xì)胞培養(yǎng)至P2代后對細(xì)胞進(jìn)行鑒定。各取100 μL細(xì)胞懸液，分別加入到含抗體的離心管中，每種抗體分成5份，3種抗體總計15管，混勻，4 ℃避光孵育30 min，同時設(shè)置一管不染抗體管，具體標(biāo)記如下(未染：不加抗體，不做染色;CD34：染CD34抗體;CD29：染CD29-FITC抗體;CD90：染CD90-FITC抗體)，PBS洗細(xì)胞2次，800 rpm離心5 min;其中CD34管繼續(xù)加入100 μL CL488-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)二抗(1∶100稀釋)，繼續(xù)避光孵育1 h，PBS洗細(xì)胞2次，800 rpm離心5 min，350 μL PBS重懸細(xì)胞。上機檢測，進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察及表面標(biāo)記抗原CD90、CD29和CD34的鑒定。

　　2.6 BMMSCs生長曲線測定

　　將P2代細(xì)胞胰酶消化，加入完全培養(yǎng)液終止消化后800 rpm離心5 min，去上清，重新加入完全培養(yǎng)液，對細(xì)胞懸液進(jìn)行計數(shù)。經(jīng)預(yù)實驗發(fā)現(xiàn)，BMMSCs在濃度為2×104個/mL時，CCK-8試劑盒檢測結(jié)果較為理想。該細(xì)胞生長周期為7 d，所以繪制完整的生長曲線需要7塊96孔板。按2×103個/孔，每孔100 μL接種到96孔板當(dāng)中，依次加入空白組、假手術(shù)組、模型組細(xì)胞懸液，每組做5個復(fù)孔。第1天，在各孔中加入CCK-8溶液10 μL，4 h后在450 nm波長處進(jìn)行OD值測定，依次7 d，繪制BMMSCs的生長曲線。

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