摘 要 以胡桃楸的成熟合子胚為外植體，采用不同消毒方式和培養方式進行組織培養研究，分析了污染率和愈傷組織誘導率。結果表明：紫外線直射15 min滅菌效果最好，污染率及褐化率均最低，分別為15.82%和22.93%;暗培養時間長利于愈傷組織的誘導，以15 d左右為佳。
關鍵詞 胡桃楸;外植體;誘導;愈傷組織
胡桃楸(Juglans mandshurica)屬胡桃科胡桃屬的落葉喬木，在我國北方地區是一類果材兼具用珍貴樹種，果實具有很高的食用價值，營養豐富，根莖葉有很高的藥用價值，木材性狀優良，在家具等行業也得到廣泛應用。由此可知胡桃楸的栽植應用前景廣闊。胡桃楸傳統育苗方式主要采取播種繁殖，其種子具有深度休眠的特性，此種繁殖方法存在需要對休眠的種子進行處理且后代無法持續地將母樹優良性狀保存下來等問題，因此，發展無性繁殖方式優越性更加明顯。
目前，胡桃楸無性繁殖方式中采取的主要方式是組織培養、扦插等，學者對胡桃楸的扦插[1，2]、組織培養[3，4]方面開展了一系列的研究，相對來說組織培養的優勢更加明顯，需要的空間小，不受到時間的限制，具有較大的擴繁系數，因此，本研究選擇組織培養的方法，外植體選擇成熟的合子胚，經過消毒、培養預處理后進行不定芽萌發效果的研究，為胡桃楸不定芽誘導植株再生體系的建立、實現育種技術的改良等方面提供一定的基礎。
1 材料與方法
1.1 試驗地點與材料
試驗所需種子采集于遼寧省凌源市青龍河國家自然保護區，地理坐標為18°51′58″—119°09′39″ E，40°46′21″—40°53′02″ N，處于凌源市的燕山東段暖溫帶北緣。保護區主要保護人參、紫椴、黃檗、野大豆等珍稀瀕危野生植物及其生境，保護天然側柏林、天然胡桃楸、天然蒙古櫟林等典型的原生植被和黑鸛、東方白鸛、金雕、大鴇等珍稀瀕危野生動物及其棲息地。
青龍河保護區內胡桃楸天然林面積較大，采集保護區內胡桃楸優良母樹種子，經過晾曬、外皮清理后放在干燥、通風、溫度20～25 ℃條件下備用。在接種前敲碎外殼，將種子尖部的合子胚(帶子葉少量)取出作為外植體用于不定芽的誘導試驗。
1.2 試驗方法
1.2.1 外植體消毒預處理試驗
外植體消毒試驗共設6個預處理，分別為：0.2%氯化汞溶液處理5 min、10 min;2%次氯酸鈉溶液處理10 min、15 min;紫外線直射10 min、15 min。預處理前先取合子胚置于75%酒精溶液中，30 min后撈出按照不同的預處理方案實施消毒處理，用無菌水沖洗4～5遍，最后在培養基上接種。所選擇的培養基為改良版的DKW空白培養基，其中每L培養基中另外添加了瓊脂6 g、蔗糖30 g，pH控制在5.8左右。6個處理均設置3次重復，每次重復內有外植體8個。接種后2周進行污染率、褐化率調查統計。
1.2.2 外植體培養方法預處理試驗
試驗中外植體經過消毒后(選擇1.2.1試驗中效果最好的消毒預處理方式)，轉移到暗環境中進行培養。培養時間共設6個處理，分別為暗培養3、6、9、12、15、18 d。培養基選擇改良后的DKW培養基(每L培養基中另外添加了蔗糖30 g、瓊脂6 g、6-BA 2.0 mg、吲哚乙酸0.01 mg，pH控制在5.8左右)，對不同暗培養時間愈傷誘導率進行調查。每個處理3次重復，每個重復內安排10個外植體。
按照不同時間處理后，將外植體接種到改良的DKW培養基上進行光培養，在控制溫度25 ℃、光照強度1 500 lx、光照周期為14 h光照10 h黑暗的條件下培養。對培養后不定芽誘導情況進行統計分析。
1.3 調查統計方法
利用Excel、DPS進行數據處理。愈傷組織誘導率(%)=外植體中產生愈傷組織的個數/外植體接種總個數×100;不定芽誘導率(%)=外植體中產生不定芽的個數/外植體接種總個數×100。各處理取3次重復平均值。
2 結果與分析
2.1 不同消毒預處理方法對胡桃楸外植體消毒效果的影響
植物外植體消毒處理的效果直接影響后期組織培養的效果。本試驗不同消毒預處理方法胡桃楸外植體污染率及褐化率見表1。根據表1可知，選擇胡桃楸的成熟胚作為外植體，消毒預處理的方法不同，污染率及褐化率表現也不同：0.2%氯化汞溶液處理5 min的污染率最高，達到70.23%，極顯著高于其他處理;其次是2%次氯酸鈉溶液處理10 min，污染率為47.28%，與0.2%氯化汞溶液處理10 min、2%次氯酸鈉溶液處理15 min的2個處理差異不顯著，但極顯著高于紫外線直射的2個處理;紫外線處理的污染率最低，且隨著直射時間的延長，污染率極顯著降低。根據表1可知，褐化率以0.2%氯化汞溶液處理10 min最高，達到62.12%，極顯著高于其他處理;其次是2%次氯酸鈉溶液的2個處理，但這2個處理之間差異不顯著;以紫外線直射的褐化率最低，為20%以下，且直射時間越長，褐化率越低。
