摘要：【目的】探討在巰乙基磺酸鈉(MESNa)與碳酸氫銨(NH4HCO3)存在下，對(duì)在大腸桿菌上表達(dá)的重組融合蛋白中內(nèi)含肽(Intein)用硫醇(DTT)進(jìn)行自剪切，促使抗菌肽(MME)碳末端實(shí)現(xiàn)酰胺化。【方法】構(gòu)建用大腸桿菌表達(dá)內(nèi)含肽介導(dǎo)的MME重組質(zhì)粒，通過表達(dá)獲得依次由“組氨酸、Sumo標(biāo)簽、MME、內(nèi)含肽”構(gòu)成的融合蛋白，用鎳柱及透析進(jìn)行純化，在MESNa和NH4HC03存在下，用DTT對(duì)內(nèi)含肽進(jìn)行白剪切，促使MME碳末端酰胺化，腸激酶切割、純化，得到碳末端酰胺化的MME。質(zhì)譜和二級(jí)串聯(lián)質(zhì)譜配合使用，檢測(cè)MME及其碳末端酰胺化。【結(jié)果】通過PCR，鑒定融合蛋白，其基因片段為837bp，符合預(yù)期。質(zhì)譜鑒定得MME相對(duì)分子量為3057.7與其理論值3057.64一致。二級(jí)串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)得MME碳端碎片的分子量為1214.728，與碳末端酰胺化的MME碳端碎片理論分子量1214.739相符，匹配度為45，表明本研究制備的MME碳末端已被酰胺化，該蛋白為可溶。【結(jié)論】用大腸桿菌成功地表達(dá)了重組融合蛋白，在MESNa與NH4HCO3存在下，促進(jìn)了內(nèi)含肽白剪切，MME碳末端被酰胺化，實(shí)現(xiàn)了簡單的“一步法”制備。質(zhì)譜與二級(jí)串聯(lián)質(zhì)譜配合使用，可靈敏、簡單地對(duì)碳末端酰胺化多肽進(jìn)行檢測(cè)，可作為該項(xiàng)檢測(cè)方法的一種選擇，結(jié)果表明，本研究成功地制備了碳末端酰胺化的MME。

　　關(guān)鍵詞：抗菌肽;酰胺化;內(nèi)含肽介導(dǎo);自剪切

　　0引言

　　【研究意義】抗生素過度使用出現(xiàn)的食品藥殘和細(xì)菌耐藥性問題[1]，使畜禽飼養(yǎng)中抗菌問題遇到了極大麻煩。抗菌肽(Antimicrobial peptides，AMPS)抗菌譜廣，細(xì)菌不大可能對(duì)其耐藥[2]。但要使AMPS產(chǎn)業(yè)化，主要還面臨著要提高其活性[3]和半衰期，降低其毒性和生產(chǎn)成本。本課題組設(shè)計(jì)并化學(xué)合成了抗菌能力強(qiáng)、半衰期長、毒性低的碳末端酰胺化的抗菌肽(MME)，其氨基酸序列為：GRGDSPKFLHSAKKFGKAFPAVLKVLTTG[4]。本研究探討通過基因工程表達(dá)法，生產(chǎn)目標(biāo)抗菌肽MME以期降低生產(chǎn)成本。

　　【前人研究進(jìn)展】獲得AMPS方法有3種：從生物體中提取、化學(xué)法合成和基因工程表達(dá)，其中第三種方法成本最低[5]。基因工程表達(dá)系統(tǒng)有多種，其中大腸桿菌(E.coli)表達(dá)系統(tǒng)優(yōu)勢(shì)明顯，因此被廣泛采用[6]。碳末端酰胺化的AMPS在人體內(nèi)有重要的生理功能，其碳端末端的α-酰胺基對(duì)AMPS的活性起著很重要作用，有些AMPS在酰胺化前后的生物活性相差可達(dá)萬倍[7];其還可起保護(hù)作用，減弱蛋白酶對(duì)AMPS的降解，延長AMPS的半衰期[8]。可是大腸桿菌直接表達(dá)的多肽產(chǎn)物碳末端均為羥基。為此，研究者提出先用基因工程手段表達(dá)碳末端為羥基的多肽，然后再進(jìn)行第二步的酰胺化修飾，最終獲得碳末端酰胺化的目標(biāo)多肽。如：重組表達(dá)α-酰胺化酶在體外進(jìn)行多肽C端酰胺化，用溴化氰裂解融合表達(dá)產(chǎn)物所得的鮭魚降鈣素的體外酰胺化加工。

　　但這些工藝都存在一些不足，前者在酰胺化過程中需提供酰胺化工具酶，制備中純化步驟多，技術(shù)要求較高，成本較大[9];后者在酰胺化過程中要使用溴化氰[10]，會(huì)對(duì)環(huán)境造成污染，制約了他們的大規(guī)模生產(chǎn)。現(xiàn)在研究者仍投入大量精力，以期開發(fā)出更完善的工藝[7]。存在于前體蛋白結(jié)構(gòu)中的內(nèi)含肽(Intein)序列，能從前體蛋白中白我剪切，還能將剪切下的兩側(cè)肽鏈連成肽鍵。Li Yifeng[11]對(duì)內(nèi)含肽的生物應(yīng)用做了較全面的介紹，周冠、俞超等[7，12]用內(nèi)含肽介導(dǎo)表達(dá)天蠶素多肽，僅用硫醇DTT對(duì)表達(dá)的融合蛋白中含有的內(nèi)含肽進(jìn)行自剪切，同時(shí)使融合蛋白中含有的抗菌肽碳末端實(shí)現(xiàn)酰胺化。Stevens A J[13]在用DTT使內(nèi)含肽自剪切時(shí)，加入了NH4HC03，以利于多肽碳末端的酰胺化。對(duì)碳末端酰胺化的抗菌肽的檢測(cè)，也是困擾研究者的又一大問題[14]。

　　【本研究切人點(diǎn)】前人研究表明，用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，最終要獲得碳末端酰胺化的AMPS還存在不少困難，主要問題是促進(jìn)表達(dá)產(chǎn)物碳末端的酰胺化。通過酰胺化酶對(duì)大腸桿菌表達(dá)所得前體蛋白進(jìn)行酰胺化與用化學(xué)合成制備法比較，雖可簡化純化工藝[14]，但需二步法制備[7]，過程仍較復(fù)雜;用內(nèi)含肽介導(dǎo)在大腸桿菌上表達(dá)含MME的融合蛋白，通過DTT實(shí)現(xiàn)內(nèi)含肽白剪切，雖可實(shí)現(xiàn)一步法制備碳末端酰胺化多肽，但酰胺化過程困難[7，12]。本研究探討在上述酰胺化體系中，引入巰乙基磺酸鈉(MESNa)和碳酸氫銨(NH4HCO3)，促進(jìn)MME碳末端酰胺化的進(jìn)行;將質(zhì)譜和二級(jí)串聯(lián)質(zhì)譜配合使用，鑒定MME，并檢測(cè)其碳末端酰胺基的存在。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究探討在MESNa和NH4HCO3存在下，用DTT對(duì)內(nèi)含肽進(jìn)行白剪切，促進(jìn)多肽碳末端酰胺化;將質(zhì)譜與二級(jí)串聯(lián)質(zhì)譜配合使用，希望能探索一種靈敏、簡單地檢測(cè)AMPS碳末端酰胺化的方法，促進(jìn)對(duì)多肽碳末端酰胺化的研究。

　　1材料與方法

　　1.1主要試劑、儀器及材料

　　1.1.1主要試劑與儀器 質(zhì)粒抽提、凝膠回收試劑盒(天根生物公司)，NdeI、XhoI和腸激酶(EK)[TaKara(大連)公司]，蛋白maker[TaKara(大連)公司]，大腸桿菌BL21(DE3)(本室保存)，PET30a(本室保存)，6×His標(biāo)簽抗體(上海生工)，IPTG、硫醇(DTT)(Solarbio)，Ni-NTA beads 6FF(天地人和公司)，其余試劑為國產(chǎn)分析純，電泳系統(tǒng)、成像系統(tǒng)(Tahon)，半干電轉(zhuǎn)儀(Tahon)，紫外可見分光光度計(jì)(日本HITACHI)，高效液相-電噴霧質(zhì)譜( Aglient)。

　　1.1.2主要溶液配制 緩沖溶液Buffer簡記：Buf，Buf A中DTT濃度為1mmol·L-1，Buf(B、C、D)中咪唑濃度分別為20mmol·L-1、40mmol·L-1和500mmol·L-1，上述緩沖液的NaCI、Na3PO4濃度分別為500mmol·L-1和25mmol·L-1， pH=7.5;Buf(E、F、G、H)中咪唑濃度分別為0、20mmol·L-1、40mmol·L-1、250mmol·L-1，上述緩沖液中的Tris、NaCl、甘油的濃度分別為20mmol·L-1、300mmol·L-1和10%，pH=8.0。

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