摘要：大豆RLPK2基因(GenBank登錄號(hào)：AY687391)是一個(gè)編碼N末端富含亮氨酸重復(fù)序列的類(lèi)受體蛋白激酶基因。為分析大豆RLPK2基因的功能，該研究以野生型擬南芥和大豆RLPK2基因過(guò)表達(dá)擬南芥植株為材料，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化野生型擬南芥，構(gòu)建了大豆RLPK2基因過(guò)表達(dá)載體，分析了葉片衰老過(guò)程中葉綠素?zé)晒鈪?shù)、抗氧化酶活性及衰老相關(guān)基因表達(dá)量的變化。結(jié)果表明：(1)無(wú)論是野生型還是轉(zhuǎn)基因擬南芥，隨著葉片衰老進(jìn)程的進(jìn)行，光系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)的最大光化學(xué)效率(Fv/Fm)、PSⅡ?qū)嶋H光化學(xué)效率(ΦPSⅡ)、光化學(xué)淬滅系數(shù)(qP)和光合電子傳遞速率(ETR)均呈下降趨勢(shì)，但后者下降趨勢(shì)更明顯;(2)激發(fā)壓(1qP)在葉片衰老前期的變化較為平穩(wěn)，后期則急劇增加，且轉(zhuǎn)基因型比野生型擬南芥增加更明顯;(3)在葉片衰老的各個(gè)時(shí)期，轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片丙二醛(MDA)含量均顯著高于野生型，而超氧化物岐化酶(SOD)、過(guò)氧化物酶(POD)和過(guò)氧化氫酶(CAT)活性均顯著低于野生型;(4)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果表明，RLPK2轉(zhuǎn)基因擬南芥中衰老標(biāo)志基因ATSAG12，衰老關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子ATNAP、ATWRKY6和葉綠素降解關(guān)鍵酶編碼基因ATACD1表達(dá)量顯著上調(diào)。綜上認(rèn)為，大豆類(lèi)受體蛋白激酶基因RLPK2參與調(diào)控植物葉片衰老進(jìn)程，其表達(dá)對(duì)葉片衰老具有促進(jìn)作用。

　　關(guān)鍵詞：大豆RLPK2基因，葉片衰老，激發(fā)壓，抗氧化酶，丙二醛

　　作為進(jìn)行光合作用的主要器官，葉片的生長(zhǎng)發(fā)育優(yōu)劣直接影響作物的生長(zhǎng)、產(chǎn)量及品質(zhì)。葉片衰老是葉片生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)程中的最終階段，它不是葉片細(xì)胞的簡(jiǎn)單死亡過(guò)程，而是一種主動(dòng)的、受細(xì)胞內(nèi)部遺傳程序控制的、器官水平上動(dòng)態(tài)的細(xì)胞程序性死亡過(guò)程，并且受到外部多種環(huán)境因素(光照、水分、溫度、礦質(zhì)元素和微生物)及內(nèi)部發(fā)育信號(hào)(激素、遺傳和基因調(diào)控)的協(xié)調(diào)控制(初夢(mèng)圓和于延沖，2019)。此外，葉片衰老還與Ca2+、糖、活性氧(relativeoxygenspecies，ROS)水平和內(nèi)源激素的變化等因素密切相關(guān)(張藝函等，2019)。葉片衰老主要表現(xiàn)為光合同化能力下降，細(xì)胞結(jié)構(gòu)的退化，光合色素包括葉綠素和類(lèi)胡蘿卜素的降解，蛋白質(zhì)和核酸降解，ROS與丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量增加，水解酶及生長(zhǎng)抑制因子持續(xù)增長(zhǎng)等，這些特征在多種植物中已有描述(Wooetal.，2013;Wangetal.，2016)。葉片衰老能夠增強(qiáng)植物對(duì)生存環(huán)境的適應(yīng)性，從而有利于其生存和延續(xù)。但對(duì)農(nóng)作物的生長(zhǎng)而言，植物過(guò)早衰老引起的葉片同化功能的減退也極大地影響和限制了農(nóng)作物產(chǎn)量潛力的發(fā)揮，導(dǎo)致作物品質(zhì)及產(chǎn)量的損失。因此，對(duì)葉片衰老機(jī)理的研究不僅在揭示植物的生態(tài)適應(yīng)等方面具有一定意義，還在糧食生產(chǎn)上抑制早衰具有重要意義。大豆在我國(guó)播種面積僅次于玉米、水稻、小麥和馬鈴薯，是第五大糧食作物，其含有豐富的植物蛋白質(zhì)，同時(shí)又可用來(lái)榨油，因此是我國(guó)重要的油料作物。相關(guān)研究表明，葉片早衰嚴(yán)重影響著大豆正常的生長(zhǎng)發(fā)育，并會(huì)引起產(chǎn)量及品質(zhì)的下降(呂林濤，2018)。鑒定大豆葉片衰老相關(guān)基因及其功能對(duì)于提高大豆的優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)和育種改良具有重要的科學(xué)意義和深遠(yuǎn)的應(yīng)用價(jià)值。

　　植物類(lèi)受體蛋白激酶(receptorlikeproteinkinase，RLKs)具有特殊的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，在植物中普遍存在，占植物蛋白激酶總量的60%，是植物中較大的基因家族之一，參與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑過(guò)程，并在植物的生長(zhǎng)發(fā)育和環(huán)境的適應(yīng)過(guò)程中具有重要作用(Shiu&Bleecker，2001)。其中，富含亮氨酸重復(fù)序列(leucinerichrepeat，LRRs)型類(lèi)受體蛋白激酶是RLKs中最大的一個(gè)亞家族(Coletteetal.，2011)。迄今為止，LRRsRLKs蛋白的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和表達(dá)模式在擬南芥(阿依江·哈拜克等，2014)、煙草(曾建斌，2011)、花生(莊瑞蓉等，2018)、馬鈴薯(謝潔等，2019)等植物中均有研究。相關(guān)研究表明，LRRRLKs在植物整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中具有重要作用(Diévart&Clark，2004)。謝潔等(2019)發(fā)現(xiàn)馬鈴薯LRR類(lèi)受體蛋白激酶SCLRRK1在低溫條件下表達(dá)受到抑制，證實(shí)其參與低溫脅迫響應(yīng)過(guò)程。Zhou等(2016)發(fā)現(xiàn)LRRRLKs型基因調(diào)節(jié)擬南芥花藥的發(fā)育過(guò)程。作為L(zhǎng)RRRLKs家族中被研究較為廣泛的一員，BAK1在油菜素內(nèi)酯(BR)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑(Heetal.，2007)、植物先天免疫反應(yīng)(韋莉等，2019)、細(xì)胞死亡調(diào)控(Zhouetal.，2019)等方面發(fā)揮作用。大豆RLPK2基因(GenBank登錄號(hào)：AY687391)是植物分子遺傳學(xué)研究組李小平副教授前期以大豆科豐34為材料篩選到的一個(gè)編碼N末端富含亮氨酸重復(fù)序列的類(lèi)受體蛋白激酶基因，前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)人工誘導(dǎo)衰老處理顯著提高了該基因在大豆初生葉片中的轉(zhuǎn)錄水平，初步分析顯示該基因可能參與大豆葉片衰老的調(diào)控過(guò)程。本研究在此基礎(chǔ)上構(gòu)建了大豆RLPK2基因過(guò)表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化野生型擬南芥，對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片衰老進(jìn)程進(jìn)行分析，進(jìn)一步揭示該基因在植物葉片衰老中的功能，以期為延緩葉片衰老從而提高大豆作物產(chǎn)量和改善作物品質(zhì)提供理論依據(jù)。

　　1材料與方法

　　1.1材料及培養(yǎng)方法

　　本試驗(yàn)所使用的擬南芥(Arabidopsisthaliana)為哥倫比亞野生型(WT)擬南芥(Columbia0)。培養(yǎng)環(huán)境條件如下：溫度為20～25℃，光暗周期為16h光照/8h黑暗，光照強(qiáng)度為100SymbolmA@

　　mol·m2·s1，相對(duì)濕度為80%。

　　1.2總RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄

　　采用QIAGEN的植物RNA提取試劑盒RNeasyPlantMiniKit按照操作說(shuō)明提取大豆品種科豐34葉片總RNA，經(jīng)微量紫外分光光度計(jì)(Merinton，美國(guó))檢測(cè)其純度和濃度，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性后，利用Thermo公司提供的cDNA試劑盒按照反轉(zhuǎn)錄說(shuō)明書(shū)合成cDNA第一條鏈。

　　1.3RLPK2全長(zhǎng)cDNA引物設(shè)計(jì)及RTPCR基因擴(kuò)增

　　利用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計(jì)RLPK2基因的特異性引物，根據(jù)Gateway技術(shù)構(gòu)建表達(dá)載體的要求，在引物5′端加上AAAAAGCAGGCTCG，引物序列如下：

　　RLPK2OXF：5′AAAAAGCAGGCTCGATGAGA

　　TCAGTAAGTTCCCCTG3′;

　　RLPK2OXR：5′AGAAAGCTGGGTTTTAATCT

　　CTCTTCTCCAAGTAAGAAG3′。

　　采用高保真PhusionDNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性30s，35個(gè)循環(huán)(94℃30s，62℃30s，72℃30s)，循環(huán)結(jié)束后72℃10min延伸反應(yīng)，4℃保溫。1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，回收特異性目標(biāo)條帶，送樣測(cè)序，選取測(cè)序正確的克隆進(jìn)行后期載體的構(gòu)建。

　　1.4RLPK2過(guò)表達(dá)載體構(gòu)建、擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化及純合體篩選

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