摘要：【目的】明確中同水仙植株根際土壤微生物群落的組成特征。【方法】采用Illumina Miseq高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)水仙根際土壤微生物樣品的保守基因區(qū)進(jìn)行測(cè)序及生物信息學(xué)分析，闡明中同水仙根際土壤的細(xì)菌、真菌和^菌群落結(jié)構(gòu)組成，并對(duì)水仙根際土壤微生物的優(yōu)勢(shì)菌屬進(jìn)行深入分析。【結(jié)果】共獲得優(yōu)化序列175840條，基于97%序列相似度，聚類(lèi)為2 680個(gè)OTUs。優(yōu)勢(shì)細(xì)菌類(lèi)群是綠彎菌門(mén)Chloroflexi( 30.86%)和變形菌門(mén)Proteobacteria(20.67%)，真菌以子囊菌門(mén)Ascomycota(84.94%)為主，屬水平上球毛殼菌Chaetomium globosum( 28.15%)和散子囊菌Eurotiales( 25.01%)占較高比例。占菌類(lèi)群主要為奇^菌門(mén)Thaumarchaeota( 51.40%)、深^菌門(mén)Bathyarchaeota(25.98%)和廣古菌門(mén)Euryarchaeota( 20.65%)。其中，來(lái)自奇古菌門(mén)的SCG類(lèi)群(25.67%)和嗜酸性氨氧化古菌Candidatus Nitrosotalea( 12.93%)占較高比例。【結(jié)論】中國(guó)水仙根際土壤微域具有豐富多樣的微生物類(lèi)群，這對(duì)于開(kāi)發(fā)和利用水仙根際土壤微生物資源具有重要意義。

　　關(guān)鍵詞：中國(guó)水仙;根際土壤微生物;高通量測(cè)序;細(xì)菌;真菌;^菌

　　引言

　　【研究意義】中國(guó)水仙(Narcissus tazetta L.var.chinensis Roem.)是石蒜科多年生草本植物，原產(chǎn)我國(guó)，已有一千多年栽培歷史，獨(dú)具天然麗質(zhì)，芬芳清新，素潔幽雅，是我國(guó)十大觀賞名花之一，觀賞價(jià)值極高，在園林造景中也有廣泛應(yīng)用。近年來(lái)，很多研究揭示了植物根際一土壤一微生物之間的相互作用機(jī)制，探明中國(guó)水仙根際土壤微生物群落分布特征對(duì)于解析中國(guó)水仙的生態(tài)生存機(jī)制具有重要意義[1-3]。但目前對(duì)中國(guó)水仙根際土壤微生物群落組成的認(rèn)知仍然有限，尤其對(duì)水仙根際土壤真菌和古菌的群落水平鮮有報(bào)道，從而不能深入解析水仙根際土壤微生物與水仙生長(zhǎng)發(fā)育的關(guān)系。【前人研究進(jìn)展】水仙根際土壤微生物組成與栽培方式、地理位置及水仙的生長(zhǎng)習(xí)性等密切相關(guān)[4]。體外噴施有效微生物群制劑，可顯著促進(jìn)水仙花的生長(zhǎng)發(fā)育[5]。已有研究證實(shí)，大量微生物類(lèi)群具有促進(jìn)植物生長(zhǎng)的機(jī)制。Ryu等[6]從擬南芥根際土壤鑒定出2種菌株，它們釋放出的一些揮發(fā)性物質(zhì)極大促進(jìn)了擬南芥的生長(zhǎng)。此外，從芽孢桿菌屬、假單胞菌屬和黃桿菌屬中，分離到多種可增強(qiáng)植物抗病性的促生菌菌株[7-9]。根際土壤微生物也包括可以抑制植物生長(zhǎng)甚至導(dǎo)致植株死亡的根際“有害菌，”如根腐病病原菌[1O]、青枯病病原菌[11]等，它們普遍分布在根際土壤環(huán)境中，略微積累，就有可能影響根際土壤微生物群落的穩(wěn)定，產(chǎn)生有害物質(zhì)，抑制植物根系對(duì)土壤養(yǎng)分的吸收，嚴(yán)重可導(dǎo)致植物死亡。根際環(huán)境成為土壤一根系一微生物互作的關(guān)鍵區(qū)域，被稱(chēng)作植物的第二基因組[12]，根際土壤微生物影響著植物的生長(zhǎng)發(fā)育，近年來(lái)一直是科學(xué)家們研究的熱點(diǎn)。【本研究切入點(diǎn)】福建省漳州市具有栽培水仙花的得天獨(dú)厚的地理環(huán)境，可提供研究水仙根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)、功能及其與植物互作的理想土壤材料。然而水仙根際土壤菌群結(jié)構(gòu)的組成特征及根際細(xì)菌、真菌和古菌的關(guān)鍵微生物類(lèi)群組成亟待深入探討。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】采集在漳州培育的漳州水仙根際土壤，利用高通量測(cè)序技術(shù)，對(duì)根際土壤中細(xì)菌、真菌和古菌群落的組成進(jìn)行系統(tǒng)鑒定，分析水仙根際土壤環(huán)境中優(yōu)勢(shì)的微生物類(lèi)群，并對(duì)其生物功能進(jìn)行探討，以期揭示中國(guó)水仙根際土壤微生物的群落分布特征，為解析水仙花的環(huán)境適應(yīng)性機(jī)制以及建立科學(xué)合理的水仙花種植制度提供理論依據(jù)。

　　1材料與方法

　　1.1根際土壤微生物樣品采集

　　土壤樣品于2020年4月25日在福建省漳州市“水仙花海”園區(qū)進(jìn)行漳州水仙金盞銀臺(tái)根際土壤的采集。用5點(diǎn)取樣法采集水仙根際土壤，去除土壤表層雜草和凋落物，在水仙植株的根部一側(cè)小心挖掘，待改側(cè)植株根系露出后，用毛刷刷取黏附在根表面的土壤。共采集5處樣地的水仙根際土壤，每處樣地選擇3株植株，每處土樣總采樣量約為50 g，各樣點(diǎn)土壤混勻后，封入滅菌的50 mL離心管，置于冰盒帶回實(shí)驗(yàn)室。約20 g新鮮土樣用于根際土壤核酸樣品提取，剩余部分置于通風(fēng)櫥中，靜置24h，磨細(xì)后過(guò)0.25 mm篩，用鋁箔紙收集，用于土壤理化性質(zhì)測(cè)定。

　　1.2土壤理化性質(zhì)測(cè)定

　　用梅特勒一托利多pH計(jì)測(cè)定土壤pH;土壤有機(jī)質(zhì)含量采用重鉻酸鉀( K2Cr207)法測(cè)定[13];土壤的全氮含量采用凱氏定氮法測(cè)定[14];采用堿解擴(kuò)散法[15]、NaHCO，浸提法[16]和醋酸銨浸提一火焰光度法[17]測(cè)定土壤堿解氮、有效磷和速效鉀含量。采用乙酸銨離心法測(cè)定土壤陽(yáng)離子交換量( Cation ExchangeCapacity，CEC)[18];用梅特勒一托利多電導(dǎo)率儀測(cè)定土壤電導(dǎo)率;采用石墨爐原子吸收光譜法測(cè)定土壤中鉛( Pb)含量[19]。

　　1.3 DNA抽提和PCR擴(kuò)增

　　根際土壤微生物DNA樣品依據(jù)PowerSoil?DNAIsolation kit( MoBio.U.S.)說(shuō)明書(shū)的操作進(jìn)行，DNA的質(zhì)量、濃度和純度通過(guò)1%的瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop2000鑒定;使用338F(5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3')和806R(5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3')[20]對(duì)16S rRNA基因V3-V4可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增;使用524FlOextF(5'-TGYCAGCCGCCGCGGTAA-3')和Arch958RmodR(5'-YCCGGCGTTGAVTCCAATT-3，)[21]對(duì)古菌16S rRNA基因的特異區(qū)間進(jìn)行PCR擴(kuò)增;使用SSU0817F(5'-TTAGCATGGAATAATRRAATAGGA-3 ')和1196R(5'-TCTGGACCTGGTGAGTTTCC-3，)[22]對(duì)真菌18S rRNA基因的特異區(qū)間進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增程序如下：95℃3 nun，35個(gè)循環(huán)(95℃30 s，58℃30 s，72℃30s)，72℃15 min，最后4℃保存(PCR儀：ABI Verity? 96型)。PCR反應(yīng)體系為：5×TransStart FastPfu 4 uL，2.5 mmol·L-l dNTPs 2 uL，上游引物(5umol·L-l) 0.8uL，下游引物(5 umol·L-I) 0.8 uL，TransStart FastPfuDNA聚合酶0.4 uL，模板DNA 10 ng，使用滅菌雙蒸水將體系補(bǔ)足至20 uL。每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

　　1.4 Illumina Miseq測(cè)序

　　使用2%瓊脂糖凝膠分離PCR產(chǎn)物，然后對(duì)相應(yīng)膠條進(jìn)行切割回收，利用MiniBEST Agarose GelDNA Extraction Kit( TaKaRa，Japan)進(jìn)行回收產(chǎn)物純化，并用QuantusrM Fluorometer( Promega，USA)對(duì)回收產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)定量。建庫(kù)依據(jù)NEXTFLEXRapid DNA-Seq Kit進(jìn)行，具體步驟如下：①在DNA片段兩端連上特定序列的接頭;②利用樣品本純化磁珠進(jìn)行片段篩選;③通過(guò)PCR擴(kuò)增實(shí)現(xiàn)原始模板的富集;④將PCR擴(kuò)增后的文庫(kù)進(jìn)行分選回收。采用Illumina Miseq測(cè)序技術(shù)(上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司)對(duì)文庫(kù)進(jìn)行高通量測(cè)序分析。原始數(shù)據(jù)上傳至NCBI SRA數(shù)據(jù)庫(kù)(序列號(hào)：SAMA16825444，Genbank登錄號(hào)：PRJNA679159)。