摘要：【目的】明確中同水仙植株根際土壤微生物群落的組成特征?！痉椒ā坎捎肐llumina Miseq高通量測序技術(shù)對水仙根際土壤微生物樣品的保守基因區(qū)進行測序及生物信息學分析，闡明中同水仙根際土壤的細菌、真菌和^菌群落結(jié)構(gòu)組成，并對水仙根際土壤微生物的優(yōu)勢菌屬進行深入分析。【結(jié)果】共獲得優(yōu)化序列175840條，基于97%序列相似度，聚類為2 680個OTUs。優(yōu)勢細菌類群是綠彎菌門Chloroflexi( 30.86%)和變形菌門Proteobacteria(20.67%)，真菌以子囊菌門Ascomycota(84.94%)為主，屬水平上球毛殼菌Chaetomium globosum( 28.15%)和散子囊菌Eurotiales( 25.01%)占較高比例。占菌類群主要為奇^菌門Thaumarchaeota( 51.40%)、深^菌門Bathyarchaeota(25.98%)和廣古菌門Euryarchaeota( 20.65%)。其中，來自奇古菌門的SCG類群(25.67%)和嗜酸性氨氧化古菌Candidatus Nitrosotalea( 12.93%)占較高比例?！窘Y(jié)論】中國水仙根際土壤微域具有豐富多樣的微生物類群，這對于開發(fā)和利用水仙根際土壤微生物資源具有重要意義。

　　關(guān)鍵詞：中國水仙;根際土壤微生物;高通量測序;細菌;真菌;^菌

　　引言

　　【研究意義】中國水仙(Narcissus tazetta L.var.chinensis Roem.)是石蒜科多年生草本植物，原產(chǎn)我國，已有一千多年栽培歷史，獨具天然麗質(zhì)，芬芳清新，素潔幽雅，是我國十大觀賞名花之一，觀賞價值極高，在園林造景中也有廣泛應(yīng)用。近年來，很多研究揭示了植物根際一土壤一微生物之間的相互作用機制，探明中國水仙根際土壤微生物群落分布特征對于解析中國水仙的生態(tài)生存機制具有重要意義[1-3]。但目前對中國水仙根際土壤微生物群落組成的認知仍然有限，尤其對水仙根際土壤真菌和古菌的群落水平鮮有報道，從而不能深入解析水仙根際土壤微生物與水仙生長發(fā)育的關(guān)系。【前人研究進展】水仙根際土壤微生物組成與栽培方式、地理位置及水仙的生長習性等密切相關(guān)[4]。體外噴施有效微生物群制劑，可顯著促進水仙花的生長發(fā)育[5]。已有研究證實，大量微生物類群具有促進植物生長的機制。Ryu等[6]從擬南芥根際土壤鑒定出2種菌株，它們釋放出的一些揮發(fā)性物質(zhì)極大促進了擬南芥的生長。此外，從芽孢桿菌屬、假單胞菌屬和黃桿菌屬中，分離到多種可增強植物抗病性的促生菌菌株[7-9]。根際土壤微生物也包括可以抑制植物生長甚至導致植株死亡的根際“有害菌，”如根腐病病原菌[1O]、青枯病病原菌[11]等，它們普遍分布在根際土壤環(huán)境中，略微積累，就有可能影響根際土壤微生物群落的穩(wěn)定，產(chǎn)生有害物質(zhì)，抑制植物根系對土壤養(yǎng)分的吸收，嚴重可導致植物死亡。根際環(huán)境成為土壤一根系一微生物互作的關(guān)鍵區(qū)域，被稱作植物的第二基因組[12]，根際土壤微生物影響著植物的生長發(fā)育，近年來一直是科學家們研究的熱點?！颈狙芯壳腥朦c】福建省漳州市具有栽培水仙花的得天獨厚的地理環(huán)境，可提供研究水仙根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)、功能及其與植物互作的理想土壤材料。然而水仙根際土壤菌群結(jié)構(gòu)的組成特征及根際細菌、真菌和古菌的關(guān)鍵微生物類群組成亟待深入探討?！緮M解決的關(guān)鍵問題】采集在漳州培育的漳州水仙根際土壤，利用高通量測序技術(shù)，對根際土壤中細菌、真菌和古菌群落的組成進行系統(tǒng)鑒定，分析水仙根際土壤環(huán)境中優(yōu)勢的微生物類群，并對其生物功能進行探討，以期揭示中國水仙根際土壤微生物的群落分布特征，為解析水仙花的環(huán)境適應(yīng)性機制以及建立科學合理的水仙花種植制度提供理論依據(jù)。

　　1材料與方法

　　1.1根際土壤微生物樣品采集

　　土壤樣品于2020年4月25日在福建省漳州市“水仙花海”園區(qū)進行漳州水仙金盞銀臺根際土壤的采集。用5點取樣法采集水仙根際土壤，去除土壤表層雜草和凋落物，在水仙植株的根部一側(cè)小心挖掘，待改側(cè)植株根系露出后，用毛刷刷取黏附在根表面的土壤。共采集5處樣地的水仙根際土壤，每處樣地選擇3株植株，每處土樣總采樣量約為50 g，各樣點土壤混勻后，封入滅菌的50 mL離心管，置于冰盒帶回實驗室。約20 g新鮮土樣用于根際土壤核酸樣品提取，剩余部分置于通風櫥中，靜置24h，磨細后過0.25 mm篩，用鋁箔紙收集，用于土壤理化性質(zhì)測定。

　　1.2土壤理化性質(zhì)測定

　　用梅特勒一托利多pH計測定土壤pH;土壤有機質(zhì)含量采用重鉻酸鉀( K2Cr207)法測定[13];土壤的全氮含量采用凱氏定氮法測定[14];采用堿解擴散法[15]、NaHCO，浸提法[16]和醋酸銨浸提一火焰光度法[17]測定土壤堿解氮、有效磷和速效鉀含量。采用乙酸銨離心法測定土壤陽離子交換量( Cation ExchangeCapacity，CEC)[18];用梅特勒一托利多電導率儀測定土壤電導率;采用石墨爐原子吸收光譜法測定土壤中鉛( Pb)含量[19]。

　　1.3 DNA抽提和PCR擴增

　　根際土壤微生物DNA樣品依據(jù)PowerSoil?DNAIsolation kit( MoBio.U.S.)說明書的操作進行，DNA的質(zhì)量、濃度和純度通過1%的瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop2000鑒定;使用338F(5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3')和806R(5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3')[20]對16S rRNA基因V3-V4可變區(qū)進行PCR擴增;使用524FlOextF(5'-TGYCAGCCGCCGCGGTAA-3')和Arch958RmodR(5'-YCCGGCGTTGAVTCCAATT-3，)[21]對古菌16S rRNA基因的特異區(qū)間進行PCR擴增;使用SSU0817F(5'-TTAGCATGGAATAATRRAATAGGA-3 ')和1196R(5'-TCTGGACCTGGTGAGTTTCC-3，)[22]對真菌18S rRNA基因的特異區(qū)間進行PCR擴增。擴增程序如下：95℃3 nun，35個循環(huán)(95℃30 s，58℃30 s，72℃30s)，72℃15 min，最后4℃保存(PCR儀：ABI Verity? 96型)。PCR反應(yīng)體系為：5×TransStart FastPfu 4 uL，2.5 mmol·L-l dNTPs 2 uL，上游引物(5umol·L-l) 0.8uL，下游引物(5 umol·L-I) 0.8 uL，TransStart FastPfuDNA聚合酶0.4 uL，模板DNA 10 ng，使用滅菌雙蒸水將體系補足至20 uL。每個樣本設(shè)置3個重復。

　　1.4 Illumina Miseq測序

　　使用2%瓊脂糖凝膠分離PCR產(chǎn)物，然后對相應(yīng)膠條進行切割回收，利用MiniBEST Agarose GelDNA Extraction Kit( TaKaRa，Japan)進行回收產(chǎn)物純化，并用QuantusrM Fluorometer( Promega，USA)對回收產(chǎn)物進行檢測定量。建庫依據(jù)NEXTFLEXRapid DNA-Seq Kit進行，具體步驟如下：①在DNA片段兩端連上特定序列的接頭;②利用樣品本純化磁珠進行片段篩選;③通過PCR擴增實現(xiàn)原始模板的富集;④將PCR擴增后的文庫進行分選回收。采用Illumina Miseq測序技術(shù)(上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司)對文庫進行高通量測序分析。原始數(shù)據(jù)上傳至NCBI SRA數(shù)據(jù)庫(序列號：SAMA16825444，Genbank登錄號：PRJNA679159)。