摘要：【目的】從羅漢果根際土壤中篩選分離出對白絹病(southern blight)與根腐病(root rot)有抑制作用的拮抗細菌，為羅漢果土傳病害生物防治提供合適菌株。【方法】采用稀釋涂布法和劃線法從羅漢果果園土壤中分離純化出拮抗細菌114株。隨后對分離出的拮抗細菌采用平板對峙法進行抑菌活性篩選。通過16S rDNA序列分析，結合菌落形態特征，生理生化特征對菌株進行鑒定?！窘Y果】22株細菌對至少1種羅漢果土傳病原真菌表現出小同程度的抑制作用。其中5株細菌即TYX-2、TYX-3、TYX-4、TYX-7和TYX-8對根腐病與白絹病抑制作用最為明顯，對羅漢果根腐病菌的抑制率分別為67.53%、57.50%、64.17%、60.00%和66.67%。對羅漢果白絹病菌的抑制率分別為83.03%、87.58%、53.3 1%、82.27%和86.67%。經過形態學、生理生化特征以及16S rDNA系統發育樹的分析，確定TYX-2、TYX-7和TYX-8為貝萊斯芽孢桿菌(Bacillus velezia)，TYX-3為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)，TYX-4為解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)。貝萊斯芽孢桿菌TYX-2、枯草：芽孢桿菌TYX-3和解淀粉芽孢桿菌TYX-4發酵液對2種羅漢果病原真菌電有較好的抑制作用，對羅漢果根腐病菌的抑菌率分別為47.83%、48.67%和45.83%，對羅漢果白絹病菌的抑菌率分別為5 2.00%、50.42%和55.83%。【結論】分離鑒定出的TYX-2、TYX-3和TYX-4分別為貝萊斯芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌，具有較高的生防應用價值，為進一步研制復合生防菌劑，防治羅漢果土傳病害奠定理論基礎。

　　關鍵詞：羅漢果;根腐病菌;白絹病菌;分離鑒定;拮抗細菌

　　引言

　　【研究意義】羅漢果Siraitia grosvenorii (Swingle)C.Jeffrey為葫蘆科Cucurbitaceae羅漢果屬Siraitia多年生草質藤本宿根植物，又名漢果、長壽果、神仙果，是我國特有甜料及珍貴藥用植物。羅漢果果實富含人體所需的多種氨基酸、維生素及多種糖類物質，具有清心潤肺、止咳消喘、清熱解毒、潤腸通便、祛痰補血、益肝、健脾、鎮靜及降壓等功效，已被廣泛應用于醫藥、保健品、飲料和調味品等領域[1]。羅漢果的藥用部位不僅是果實，根和葉也可入藥，對治療消化系統疾病，降低血壓功效顯著;羅漢果甜素具有甜度高，不含熱量，無毒等優點，符合目前食品市場對低熱量甜味劑的需求，在保健食品領域發展前景廣闊[2]。

　　但以白絹病、根腐病為主的羅漢果土傳病害嚴重影響果實產量。僅2003 2005年桂林羅漢果種植區因病害死亡共計234789株，經濟損失達586.97萬元。白絹病病菌能危害100多科的500多種植物，主要通過侵染植物幼苗近地面的根莖部發病[3]，發病植株根部產生白色菌絲持續蔓延，在后期可形成褐色菌核。羅漢果根腐病發病癥狀表現在地上、地下2個部分。地下部分：須根少并完全腐爛，主根呈黑色逐漸腐爛。

　　地上部分：植株矮小，底葉變黃枯落，最后整株葉片萎蔫、枯死[4]。土傳根系病害發生除與病原菌有關外，還常伴隨根際土壤微生物區系異常，有害微生物數量增加，有益微生物數量減少，嚴重影響植物健康[5]。因此，如何全面有效地防治這類土傳病害已經成為植物生產上的當務之急。【前人研究進展】拮抗菌的篩選鑒定是植物生物防治中的關鍵環節。有研究表明從健康草莓根際土壤中分離出的多粘類芽孢桿菌可使草莓根腐病菌尖孢鐮刀菌菌絲畸形生長[6]。Sid Ahmed等[7]從甜椒根基組織中分離出4株芽孢桿菌，可有效降低疫霉菌侵害，與對照組相比根系腐爛情況降低80%。

　　季倩茹等[8]將巨大芽孢桿菌B213、多粘類芽孢桿菌B207和枯草芽孢桿菌B204 3種芽孢桿菌聯合施用后在盆栽實驗中可有效抑制黃瓜枯萎病的發生。這些研究結果表明從植物根系土壤中分離鑒定的拮抗菌具有良好的生防效果，在生物防治中發揮重要作用。【本研究切入點】目前生防微生物的研究多集中在辣椒、草莓等大面積種植的作物，對羅漢果土傳病害拮抗菌的研究較少，因此本研究從健康羅漢果根系土壤中分離純化拮抗細菌，對其進行抑菌效果測定，對效果較好的菌株進行鑒定并探究其發酵產物活性?！緮M解決的關鍵問題】篩選出的拮抗菌株，進一步開展利用拮抗微生物防治羅漢果土傳病害的研究，旨在探討有效的羅漢果土傳病害綠色防控新技術，解決目前該類病害危害嚴重、防治困難以及因化學防治造成的羅漢果產品農藥殘留問題，為羅漢果產業的健康可持續發展提供有效的技術支持。

　　1材料與方法

　　1.1材料與試劑

　　病原菌：腐皮鐮孢菌(Fusarium solani)，羅耳阿太菌(Athelia rolfsii)均從桂林市臨桂區羅漢果種植園內采集具有羅漢果根腐病與白絹病典型癥狀的病株中分離得到。

　　拮抗細菌：從桂林市臨桂區羅漢果種植園內健康羅漢果根際土壤中分離得到。

　　LB培養基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化鈉10 g，去離子水1000 mL，pH 7.0。

　　LB固體培養基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化鈉10 g，瓊脂20 g，用去離子水定容至1000 mL，pH 7.0。

　　牛肉膏蛋白胨培養基(NA)：牛肉膏3 9，蛋白胨10 g，瓊脂20 g，蒸餾水1000 mL，pH 7.0。

　　PDA培養基：馬鈴薯200 g，蔗糖20 g，瓊脂20 g，水1000 mL，pH自然。

　　1.2試驗儀器

　　主要儀器：超凈工作臺ZHJH-C1112C，上海智城;恒溫培養箱，韶關泰宏醫療器械;恒溫搖床LY2-2102C，上海龍躍;紫外可見光分光光度計UV-1200，上海美普達。

　　1.3試驗方法

　　1.3.1土壤拮抗細菌的分離 選取自然狀態下生長較為粗壯的羅漢果苗，緩慢抖落根部土壤后取附著在根際表面的土壤，參考柳慧麗[9]的方法，將10 g健康羅漢果根際土壤樣品放入裝有90 mL無菌水的250 mL滅菌三角瓶中，將三角瓶置于37℃，200r·mm_1搖床振蕩20 min，使之充分懸浮后在80℃水浴條件下加熱10 min后用無菌水稀釋至10-3、10-4、10-5、10 6等4個濃度梯度。分別吸取100 uL土壤懸液用涂布法接于牛肉膏培養基上，每種濃度梯度重復3次，置于30℃培養箱培養24-48 h，定時觀察并挑取單菌落進行平板劃線純化。將平板置于4℃冰箱內保存。

　　1.3.2土壤拮抗細菌對羅漢果土傳病原真菌的抑菌活性測定 采用平板對峙法測定土壤細菌對羅漢果根腐病菌和白絹病菌的抑菌活性。在無菌操作臺內用直徑為4 mm的打孔器在恒溫28℃，培養3d的病原菌落邊緣打孔，用無菌接種針將菌餅接于PDA平板中央，同時在病原菌兩側2.5 cm處用接種環取分離菌株劃線，對照組只接病原菌而不接種拮抗細菌( CK)。每個處理重復3次。28℃恒溫培養，培養7d后測量病原真菌菌落半徑，計算抑菌率[1O]。

　　抑菌率/% -[(對照菌落半徑處理菌落短半徑)/(對照菌落半徑0.2 cm)]×100

　　1.3.3拮抗菌株鑒定 形態觀察：將活化后的菌株用劃線法接入平板，30℃培養24h，觀察菌落的生長情況、顏色和形態特征。生理生化檢測：將篩選的拮抗菌于LB液體培養基30℃培養24h后用于生理生化的測定，測定指標包括革蘭氏染色、VP( Voges-Proskauer)實驗、接觸酶實驗、吲哚產生實驗、明膠液化實驗、甲基紅實驗、阿拉伯糖發酵實驗、甘露醇發酵實驗、麥芽糖發酵實驗、木糖發酵實驗、葡萄糖發酵實驗、蔗糖發酵實驗。具體方法參照《常見細菌系統鑒定手冊》[11]。分子鑒定：采用細菌通用物27f： AGAGTTTGATCMTGGCTCAG和1492R： TACGGYTACCTTGTTACGACTT對其進行PCR擴增。反應體系30 uL。PCR擴增反應條件為95℃5 min. 95℃30 s，55℃30 s，72℃1min，35個循環，72℃10 min，12℃終止反應。送至北京六合華大基因科技有限公司武漢分公司進行檢測純化及測序。登錄NCBI網站(www.ncbi.nlm.nih.gov)利用Blast軟件將獲得基因序列與GenB ank中已知的序列進行同源性比對分析，選擇同源性相近的序列進行系統進化分析，序列先進行多重比對，然后用MEGA6軟件采用鄰接法(Kimura's 2-parameter模型，bootstrap 1000)構建系統發育樹，明確拮抗菌株的系統發育學地位。