摘要 [目的]探索豬血漿白蛋白的高效提取方法。[方法]對(duì)低溫乙醇法在豬血漿白蛋白提取中的適用性進(jìn)行了研究，設(shè)定豬血漿白蛋白提取步驟，并對(duì)離心速度、反應(yīng)時(shí)間、pH、適用溫度4個(gè)關(guān)鍵參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行定性定量分析。[結(jié)果]低溫乙醇法適合提取豬血漿白蛋白，最佳提取條件為離心速度8 000 r/min，反應(yīng)時(shí)間90 min，pH 4.7，溫度-8 ℃;采用改良后的低溫乙醇法，1 L豬血漿可提取白蛋白29.3 g，產(chǎn)品純度為97.3%，提取時(shí)長(zhǎng)約10 h。[結(jié)論]改良后的低溫乙醇法是一種高效提取豬血漿白蛋白的可靠方法。

　　關(guān)鍵詞 豬血漿;白蛋白;提取;低溫乙醇法;優(yōu)化

　　隨著養(yǎng)豬業(yè)的迅猛發(fā)展，豬血等副產(chǎn)品產(chǎn)量急劇增加。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2018年我國(guó)豬血產(chǎn)量接近200萬(wàn)t，其中被收集利用的不到50%[1]。如何充分利用豬血資源開發(fā)高附加值產(chǎn)品，是擺在科研人員面前的現(xiàn)實(shí)課題[2]。

　　血液占活豬體重的3%～5%，主要由血漿和血細(xì)胞組成，其中血漿占血液總體積的55%，蛋白質(zhì)約占血漿總質(zhì)量的6.0%～7.5%。豬血漿含有豐富的纖維蛋白原、白蛋白、球蛋白、凝血因子等活性蛋白，是極具開發(fā)價(jià)值和開發(fā)潛力的稀有蛋白[3]。因此，從豬血中提取各種活性蛋白，是生物藥物行業(yè)的現(xiàn)實(shí)需求。

　　隨著血液蛋白提取技術(shù)的日益成熟，大量具有生物活性的血漿源蛋白被提取出來(lái)，并最終形成高附加值的醫(yī)療產(chǎn)品，極大地促進(jìn)了疾病治療和生物產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[4]。血漿中的白蛋白因在血液循環(huán)、滲透壓維持、解毒、脂類代謝以及物質(zhì)運(yùn)輸、抗氧化等方面發(fā)揮著非常重要的生理功能，已在醫(yī)療領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[5-6]。血漿白蛋白臨床用量的不斷增加以及血源短缺，血漿白蛋白供不應(yīng)求，需大量進(jìn)口以彌補(bǔ)市場(chǎng)需求。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2013、2014、2015、2016、2017年我國(guó)進(jìn)口人血白蛋白分別占白蛋白簽發(fā)總量的46.39%、57.79%、55.59%、58.76%和 59.83%。因豬與人類之間的基因相似度達(dá)83%，且飼養(yǎng)管理與疾病預(yù)防控制水平日趨成熟，使得從豬血漿中提取白蛋白并加改造修飾以替代人血漿白蛋白具有較大的可能[7]。學(xué)者對(duì)人血漿白蛋白提取研究與應(yīng)用一直沒有停步[8-9]，鹽析法、利凡諾法、熱乙醇法等多種提取方法先后建立并被應(yīng)用，但產(chǎn)品品質(zhì)不高、操作復(fù)雜、成本過高、耗時(shí)過長(zhǎng)、對(duì)環(huán)境及設(shè)備要求嚴(yán)苛以及有害物殘留等不足也逐漸呈現(xiàn)，這些問題阻礙了血漿白蛋白產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[10]。

　　為開發(fā)豬血漿白蛋白資源，筆者對(duì)低溫乙醇法的適用性進(jìn)行了研究，并確定了離心速度、反應(yīng)時(shí)間、pH、適用溫度等豬血漿白蛋白提取關(guān)鍵參數(shù)，旨在為豬血漿白蛋白的規(guī)模化制備提供參考。

　　1 材料與方法

　　1.1 原料血漿

　　豬血漿由南岳山區(qū)生物資源保護(hù)與利用湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室制備，具體方法為：采集新鮮豬血，按照9∶1的比例添加3.8%(M/V)的檸檬酸三鈉，攪拌均勻，進(jìn)行抗凝處理。抗凝血液于4 ℃、1 000 r/min離心30 min，獲取上清液，再于4 ℃、3 000 r/min離心30 min，再次獲取上清液。反復(fù)數(shù)次，直至得到清亮的血漿。離心所得血漿分裝后，-20 ℃儲(chǔ)藏備用。

　　1.2 主要試劑

　　無(wú)水乙醇購(gòu)自湖南匯虹試劑有限公司，檸檬酸三鈉、丙烯酰胺、過硫酸銨、異丙醇、甘油、TEMED、2-ME等購(gòu)自上海易恩公司，標(biāo)準(zhǔn)酪蛋白購(gòu)自Sigma公司，甲雙叉丙烯酰胺、蛋白Mark、SDS購(gòu)自北京Slarbio公司，溴麝香草酚藍(lán)購(gòu)自上海瑞永公司。

　　1.3 主要儀器

　　低溫離心機(jī)，Eppendorf;低溫恒溫槽，江蘇恒諾儀器制造有限公司;可見分光光度計(jì)，尤尼柯儀器有限公司;電熱恒溫水浴鍋，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;pH計(jì)，優(yōu)特儀器有限公司;凝膠成像系統(tǒng)，美國(guó)Bio-Rad公司;蛋白超濾系統(tǒng)，美國(guó)PALL公司;全自動(dòng)電泳儀，美國(guó)海倫娜公司。

　　1.4 試驗(yàn)方法

　　1.4.1 豬血漿蛋白含量的測(cè)定。采用雙縮脲法測(cè)定豬血漿蛋白濃度，各成分配比見表1。具體操作為：將血漿與試劑按表1配比混勻，37 ℃水浴20 min后冷卻至室溫，在紫外分光光度計(jì)波長(zhǎng)540 nm處進(jìn)行吸光度值檢測(cè)，換算得濃度數(shù)據(jù)。

　　1.4.2

　　豬血漿白蛋白的初步分離。①用0.9% 的NaCl溶液稀釋血漿至蛋白含量5%左右，用1 mol/L的檸檬酸調(diào)pH至6.5～6.8，降溫至(1.0±0.5)℃，緩慢加入-15 ℃、95%的乙醇(按每1 000 mL血漿制品加267 mL 95%乙醇計(jì)算，并控制乙醇終濃度為20%)，邊加入邊攪拌，加完后復(fù)調(diào)pH至6.5～6.8。待溫度至-4.5～-5.0 ℃時(shí)開始離心，離心溫度控制在-3.0～-5.0 ℃，離心至上清液澄清，去沉淀，取上清液備用。②取上清液，用1 mol/L的醋酸緩沖液調(diào)pH至6.5～6.8，緩慢加入95%的冰乙醇，邊加入邊攪拌，控制最終乙醇濃度為40%左右，加完后復(fù)調(diào)pH至6.5～6.8，整個(gè)反應(yīng)溫度控制在-4.2～-5.0 ℃，離心至上清液澄清，棄沉淀，收集上清液。③取上清液，用2 mol/L的醋酸溶液調(diào)節(jié)pH至4.7～4.8，在低溫條件下(-5.0～-7.0 ℃)離心至上清液澄清，取沉淀，沉淀即為血漿白蛋白。

　　1.4.3 豬血漿白蛋白純化及過濾。配制沉淀量5倍的8.5%乙醇溶液作為溶解液，溫度控制為3.0～5.0 ℃。白蛋白沉淀稱重后放入溶解液中，攪拌至沉淀完全溶解，此時(shí)反應(yīng)溫度控制在-3.0～-3.5 ℃。待沉淀完全溶解后，用除菌濾膜過濾至濾液澄清，壓濾不超過0.2 MPa。

　　用1 mol/L碳酸氫鈉調(diào)節(jié)pH至6.8～7.1，中空纖維超濾脫醇，濃縮蛋白濃度至10%～13%，采用9倍純水連續(xù)等體積透析，使蛋白終濃度為20%，按1 g蛋白質(zhì)加入0.165 mmol 辛酸鈉，并用1 mol/L碳酸氫鈉調(diào)節(jié)pH至6.8～7.2后進(jìn)行過濾除菌，將成品進(jìn)行分裝、低溫凍存。

　　1.4.4

　　豬血漿白蛋白的定性定量鑒定。采用SDS-PAGE法測(cè)定豬血漿白蛋白分子量，具體操作如下：采用5%濃縮膠、10%分離膠，依次上樣后，上層80 V電泳30 min，下層120 V電泳60 min，用凝膠成像系統(tǒng)對(duì)SDS-PAGE 電泳結(jié)果進(jìn)行圖譜分析。

　　取0.1 g凍干后的粗蛋白沉淀，充分溶于100 mL的純凈水中，利用全自動(dòng)電泳分析儀完成蛋白定量檢測(cè)，直接獲取蛋白純度和含量數(shù)據(jù)。

　　1.4.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析方法。采用SPSS 15.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

　　2 結(jié)果與分析

　　2.1 白蛋白的定性定量檢測(cè)

　　SDS-PAGE電泳圖譜分析結(jié)果見圖1。由圖1可見，提取產(chǎn)物在6.64 kD處出現(xiàn)標(biāo)志性條帶，與豬血白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品條帶大小一致。全自動(dòng)電泳分析儀獲得掃描圖像(圖2)，結(jié)果顯示，豬血漿白蛋白峰單一且集中，說明提取的蛋白純度較高。

　　2.2 離心速度對(duì)豬血漿白蛋白提取結(jié)果的影響

　　由檢測(cè)結(jié)果可知，離心速度對(duì)豬血漿白蛋白得率和純度存在顯著影響，具體見表2。

　　由表2可知，離心速度在8 000 r/min時(shí)，目標(biāo)蛋白的得率和純度顯著高于6 000和10 000 r/min，說明8 000 r/min的離心速度適合豬血漿白蛋白的提取。

　　2.3 反應(yīng)時(shí)間對(duì)豬血漿白蛋白提取結(jié)果的影響

　　檢測(cè)結(jié)果表明，反應(yīng)時(shí)間對(duì)豬血漿白蛋白的提取純度存在顯著影響(表3)。

　　由表3可知，乙醇與血漿蛋白作用時(shí)間為120 min時(shí)，蛋白得率和蛋白純度最高，但與作用90 min時(shí)沒有顯著差異，為節(jié)約時(shí)間、提高提取效率，反應(yīng)時(shí)間采用90 min。

　　2.4 pH對(duì)豬血漿白蛋白提取結(jié)果的影響

　　由表4可知，當(dāng)環(huán)境pH為4.7時(shí)，目標(biāo)蛋白的得率和純度最高，且顯著高于pH為4.0和5.4時(shí)的得率和純度。

　　2.5 反應(yīng)溫度對(duì)豬血漿白蛋白提取結(jié)果的影響

　　結(jié)果見表5。由表5可知，溫度為-8 ℃時(shí)，目標(biāo)蛋白的得率和純度顯著高于-4和-12 ℃，說明提取豬血漿白蛋白的適宜溫度為-8 ℃。

　　3 結(jié)論與討論

　　由于豬的遺傳背景、器官大小、形態(tài)和功能與人有著高度的相似性，故豬血液制品在醫(yī)療領(lǐng)域的應(yīng)用越來(lái)越受到廣泛關(guān)注，特別是現(xiàn)在白蛋白在醫(yī)療方面的廣泛應(yīng)用以及人血的供應(yīng)不足，導(dǎo)致對(duì)豬血白蛋白替代人血白蛋白的研究越來(lái)越引起學(xué)者的關(guān)注[11]。豬血白蛋白替代人血白蛋白的首要問題是從豬血漿中獲得高質(zhì)量的白蛋白。

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