摘要：以馬鈴薯品種隴薯11號試管薯為受體材料，通過農桿菌介導法，將PVX、PVS、PVY和PLRV 4種病毒CP融合基因導入馬鈴薯，并對影響遺傳轉化的因素進行了優化。結果表明，薯片分化和生根階段的選擇壓分別為Kan 50、75 mg/L，薯片分化和生根階段有效抑菌濃度分別為Cb 500、200 mg/L，農桿菌活化時間為4.5 h、侵染時間為7 min、共培養時間為2 d時利于遺傳轉化。通過該體系將4種病毒CP融合基因導入馬鈴薯，獲得了具卡那霉素抗性的轉化植株，經PCR檢測，外源基因已導入馬鈴薯基因組中。

　　關鍵詞：馬鈴薯;試管薯;農桿菌介導;遺傳轉化

　　馬鈴薯是一種產量高、適應性強、分布廣、營養豐富、經濟價值高的宜糧、宜菜、宜飼、宜作工業原料的經濟作物[1 - 2 ]。馬鈴薯在生長期間易受多種病毒的危害，病毒侵染造成馬鈴薯種質退化，產量嚴重降低。迄今為止，幾乎沒有有效的化學藥劑來防治病毒病，目前解決馬鈴薯退化的有效途徑是組培脫毒，但該法成本高且工作量大，不能解決病毒的再侵染問題，能維護無毒或低毒的有效期不長，2～3 a后產量又會嚴重下降。馬鈴薯是同源四倍體作物，若采用常規方法選育抗病毒品種，則存在天然抗性基因資源缺乏，且育種周期長、抗性基因的遺傳不穩定以及遠緣雜交種間障礙等問題。馬鈴薯抗病毒基因工程的發展解決了這一難題，通過基因工程改良馬鈴薯品種具有基因明確、產物已知、目標具體、準確快速、可預見性強等優勢，且馬鈴薯是無性繁殖植物，轉基因植株無性后代不發生分離，給轉基因植株的檢測、鑒定帶來諸多方便。

　　建立高效的遺傳轉化體系對于獲得轉基因植株至關重要。在馬鈴薯遺傳轉化中以葉片、莖段、薯片作為受體已廣泛應用，其中試管薯片作為受體材料傷口面積大，且薯塊本身含有較高含量的酚類物質，有助于農桿菌的侵染和轉化[3 - 5 ]，不經愈傷化可直接誘導芽再生。薯片轉化過程中不需要預培養，操作簡單方便，周期短，但針對不同基因型轉化的適宜條件有一定差異。我們以馬鈴薯品種隴薯11號脫毒試管苗為材料，采用農桿菌菌株LBA4404為介導，將PVX、PVS、PVY和PLRV 4種病毒外殼蛋白融合基因導入馬鈴薯，并通過對選擇壓、抗菌素濃度、農桿菌菌液濃度、侵染時間、共培養時間等因素進行選擇，建立了一套優化的高效轉化體系。

　　1 材料與方法

　　1.1 試驗材料

　　供試材料為馬鈴薯品種隴薯11號脫毒苗，由甘肅省農業科學院馬鈴薯研究所種質資源與生物技術研究室提供。供試菌株LBA4404含有質粒pART27-XSYV-rh(甘肅省馬鈴薯種質資源創新工程實驗室構建)[6 ]，pART27- XSYV-rh含4 種病毒(PVX、PVS、PVY 和 PLRV)CP基因片段，抗性標記為卡拉霉素(Kan)。DNA凝膠回收試劑盒、質粒提取試劑盒、植物總RNA提取試劑盒均購自天根生化科技(北京)有限公司。培養基基礎成分、植物激素、抗生素、添加劑均購自美國Sigma 公司。其他試劑均為國產分析純。

　　1.2 培養基

　　YEP液體培養基為10 g/L酵母提取物+ 10 g/L蛋白胨+5 g/L牛肉膏。試管薯誘導培養基為MS培養基+6-芐氨基嘌呤(6-BA)5 mg/L。試管薯片分化培養基為MS培養基+吲哚乙酸(IAA)1.0 mg/L+赤霉素(GA3)0.2 mg/L+6-芐氨基嘌呤(6-BA)0.5 mg/L+玉米素核苷(ZT)2.0 mg/L。生根培養基為1/2 MS培養基。

　　1.3 轉化外植體的獲得

　　將隴薯11號試管苗在MS固體培養基上培養21 d，長成壯苗后用于誘導試管薯。參照“固體+液體”的方法誘導試管苗結薯[7 ]。

　　1.4 遺傳轉化體系優化

　　1.4.1 誘導芽與生根選擇壓確定 無菌條件下取直徑約為0.5 cm的隴薯11號試管薯，切成厚度為2 mm左右的薄片，分別接種于附加0、25、50、75、100 mg/L 卡拉霉素(Kanamycin，Kan)的試管薯片分化培養基中，每處理接種20塊，3次重復，間隔14 d繼代1次，接種28 d后觀察薯片生長情況并統計出芽率，確定抑制芽分化的最低Kan濃度。將隴薯11號試管苗剪成帶2個腋芽的莖段，分別接到含Kan濃度0、25、50、75、100 mg/L的生根培養基中，3個重復，21 d后觀察并記錄生根狀況，確定抑制生根最適Kan濃度。

　　1.4.2 農桿菌工程菌生長曲線 挑取農桿菌菌種，接種于含Kan 50 mg/L、鏈霉素(Streptomycin，Str)50 mg/L和利福平(Rifampicin，Rif)20 mg/L的YEP平板上，置28 ℃暗培養，2 d后挑取單菌落放入5 mL含有同樣抗生素的YEP液體培養基中，于28 ℃、260 rpm條件下避光振蕩培養約24～36 h。將活化好的菌液按1∶50放大培養(即取1 mL活化好的菌液加入到50 mL含Kan 50 mg/L、Str 50 mg/L、Rif 20 mg/L的YEP液體培養基中，再置于28 ℃恒溫搖床，260 rpm條件下避光振蕩培養)，分別設1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0 h共13個時間梯度，每個時間段各取2 mL菌液，在波長600 nm下用分光光度計測定其紫外吸收值OD600，每處理3次重復，用未加菌液的YEP液體培養基調零，計算3次重復樣品的OD600平均值，最終確定農桿菌達到對數生長期所需的搖菌時間(即OD600=0.5左右的臨界點)。

　　1.4.3 侵染時間 用OD600=0.5的農桿菌菌液侵染薯片，侵染時間設為3、5、7、9、11、13、15 min，接種于試管薯片分化培養基上，每個培養皿20塊，每處理3次重復，20 d后統計薯塊出芽率、污染率及褐化率。

　　出芽率=(出抗性芽薯塊數/接種薯塊總數)×100%

　　污染率=(污染的薯塊數/接種薯塊總數)×100%

　　褐化率=(褐化的薯塊數/接種薯塊總數)×100%

　　1.4.4 共培養時間 選擇侵染7 min的處理置于28 ℃、黑暗條件下共培養，共培養時間設為1、2、3、4 d，30 d后觀察薯塊生長狀態，統計出芽率。

　　1.4.5 抑菌劑濃度 將共培養后的薯塊分別轉接到附加羧芐青霉素(Carbenicillin，Cb)100、150、200、250、300、350、400、450、500 mg/L的試管薯片分化培養基中，光照時間為14 h/d，培養溫度為(25±2) ℃，7 d后觀察農桿菌溢出情況。將分化出的芽分別轉接到附加Cb 100、150、200、250、300、350、400、450、500 mg/L的生根培養基中，7 d后觀察農桿菌溢出情況。

　　1.5 轉基因植株鑒定

　　采用CTAB法提取待檢測植株和對照植株葉片總DNA，參照賈小霞等[8 ]的方法對轉基因馬鈴薯植株進行PCR鑒定。以非轉基因馬鈴薯植株為陰性對照，pART27- XSYV-rh質粒為陽性對照。反應程序：98 ℃ 10 s，55 ℃ 5 s，72 ℃ 60 s，循環35次，72 ℃ 10 min。取5 uL PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，分離并觀察擴增產物。

　　2 結果與分析

　　2.1 Kan濃度對試管薯片芽分化及生根的影響

　　觀察發現，試管薯片在芽分化培養基上培養14～21 d后，不加Kan的薯片直接分化長出綠色健壯小芽。Kan濃度為25 mg/L時，薯片增厚、變大、顏色鮮綠，分化出芽情況與不加Kan無明顯差異;Kan濃度為50 mg/L時，薯片稍有膨大，顏色暗綠，不能分化出芽;Kan濃度為75 mg/L時，部分薯片膨大，顏色發暗，褐化嚴重;Kan濃度為100 mg/L時，薯片全部褐化死亡。因此確定芽誘導時Kan濃度為50 mg/L。

　　在抗性芽生根階段仍需要加入Kan，以防止產生大量假陽性植株。接種28 d后，不加Kan的植株生長旺盛，根系發達，而加入Kan的處理雖然也有植株生長，但是隨著Kan濃度的增加生根受限。Kan濃度為25 mg/L時，植株生根正常;Kan濃度為50 mg/L時，能正常生根，但植株生長緩慢;Kan濃度為75 mg/L時，部分植株生根，葉片發黃;Kan濃度為100 mg/L時，幾乎沒有根系，葉片全部發黃。因此確定生根時 Kan濃度為75 mg/L。

　　2.2 農桿菌工程菌活化時間確定

　　農桿菌液活化時間對于遺傳轉化的效果至關重要，活化時間短，菌液濃度過低，不利于侵染，轉化率較低，菌液濃度過高，容易使薯片傷口褐化死亡。從含有質粒pART27-XSYV-rh的農桿菌LBA4404- pART27- XSYV- rh的生長曲線測定結果(表1)。可以看出，活化培養時間為4.5 h左右時農桿菌生長最快。

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