期刊VIP學術指導 符合學術規范和道德
保障品質 保證專業,沒有后顧之憂
摘 要:枯草芽孢桿菌HS09具備較好益生菌性能,已作為微生態菌劑應用于水產養殖業。為了提高菌株HS09產芽孢發酵水平,以芽孢產量為指標,通過單因素試驗及正交試驗對枯草芽孢桿菌HS09產芽孢發酵培養基的碳源、氮源進行篩選及優化,確定最佳發酵培養基。結果表明:影響枯草芽孢桿菌HS09芽孢產量的主次因素為玉米粉>硫酸銨>葡萄糖。枯草芽孢桿菌HS09產芽孢發酵優化培養基為葡萄糖10 g·L-1、硫酸銨8 g·L-1、玉米粉15 g·L-1、硫酸鎂0.5 g·L-1、硫酸錳0.5 g·L-1、磷酸氫二鉀1 g·L-1 、磷酸二氫鉀2 g·L-1、碳酸鈣3 g·L-1;以最佳產孢發酵培養基進行200 L發酵罐放大發酵,發酵有效菌落數可達4.3×109 cfu·mL-1,實現芽孢90%高轉化率。該研究結果可為菌株工業化生產提供參考依據。
關鍵詞:枯草芽孢桿菌;培養基;優化;正交試驗
枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis是芽孢桿菌屬的一種腐生細菌,由于發酵能夠產生蛋白酶、α-淀粉酶、纖維素酶、β-葡聚糖酶、植酸酶、果膠酶等十幾種酶[1],是重要的微生態益生菌。我國水產養殖業高速發展,但近年來水產養殖業在養殖密度和規模不斷擴大的同時,也面臨著日益嚴峻的食品安全問題。傳統的抗生素雖然在治療動物疾病、促進動物生長方面有明顯優勢,但其負面效應也日益突出,表現為病原微生物產生耐藥性、不易降解等缺點,從而危害人類健康。因此,抗生素替代品益生菌、酶制劑等產品成為綠色飼料添加劑的熱點[2-3]。微生態制劑作為抗生素的替代物之一,因其無毒副作用及不存在抗藥性等優點,在養殖業中具有廣闊的應用前景[4]。枯草芽孢桿菌是飼用微生態制劑的常用菌種之一[5],其對水產中的弧菌、大腸桿菌和桿狀病毒等有害微生物有很強的抑制作用,能夠有效預防水產動物腸炎、爛鰓等疾病;能夠分解養殖池中的有毒有害物質,凈化水質;同時具有較強的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶活性,能夠促進飼料中營養素降解,使水產類動物對飼料的吸收利用更加充分;能夠減少對蝦病害發生,可以大大提高對蝦產量,從而提高經濟效益[6-8]。
為了便于運輸、保存及應用,芽孢桿菌型微生態制劑通常加工為芽孢菌粉。枯草芽孢桿菌HS09具備較好的益生菌性能,常作為微生態菌劑應用于水產養殖業。為了提高產孢發酵水平,本研究進行枯草芽孢桿菌HS09培養基優化,以期降低生產成本,旨在為枯草芽孢桿菌微生態粉劑的工業化生產提供參考依據。
1 材料與方法
1.1 菌株
枯草芽孢桿菌HS09,由福建匯盛生物科技有限公司研發中心菌種室保藏。
1.2 培養基
(1)平皿培養基:酵母粉5 g,蛋白胨10 g,氯化鈉10 g,瓊脂20 g,水1000 mL,pH 7.2。
(2)種子培養基:酵母粉5 g,蛋白胨10 g,氯化鈉10 g,水1000 mL,pH 7.2。
(3)碳源基礎發酵培養基:酵母粉8 g,豆粕粉20 g,硫酸鎂0.5 g,硫酸錳0.5 g,磷酸氫二鉀1 g,磷酸二氫鉀2 g,碳酸鈣3 g,水1000 mL。
(4)氮源基礎發酵培養基:葡萄糖10 g,硫酸鎂0.5 g,硫酸錳0.5 g,磷酸氫二鉀1 g,磷酸二氫鉀2 g,碳酸鈣3 g,水1000 mL。
1.3 試驗方法
1.3.1 搖瓶發酵培養 從活化到期的枯草芽孢桿菌HS09平皿挑取2個單菌落接入種子培養基(100 mL/500 mL三角瓶)中,置于37℃,180 r·min-1搖床中培養16 h,按照體積5%的接種量移入發酵培養基(500 mL/2000 mL三角瓶)中,置于37℃,200 r·min-1搖床中培養24 h。
1.3.2 碳氮源單因素優化 (1)培養基碳源篩選:在碳源基礎發酵培養基中,分別加入葡萄糖、糖蜜、蔗糖、玉米淀粉各10 g·L-1,初始pH 6.8條件下發酵培養,考察不同碳源對枯草芽孢桿菌HS09發酵有效菌數及芽孢產量的影響。(2)培養基氮源篩選:在氮源基礎發酵培養基中,分別加入硫酸銨、酵母粉、蛋白胨、豆粕粉、玉米粉各20 g·L-1,初始pH 6.8條件下發酵培養,考察不同單一氮源對枯草芽孢桿菌HS09發酵有效菌數及芽孢產量的影響。(3)復合氮源的優化:在單一氮源試驗結果的基礎上進行復合氮源配比試驗,復合氮源配比方案見表1,在初始pH值6.8條件下發酵培養,考察復合氮源對枯草芽孢桿菌HS09發酵有效菌數及芽孢產量的影響。
1.3.3 碳氮源正交優化 在碳氮源單因素優化基礎上,選擇葡萄糖、硫酸銨、玉米粉3個因素,設計L9(34)正交試驗優化,L9(34)正交試驗設計因素及水平見表2。
1.3.4 200 L發酵罐放大培養 從活化到期的枯草芽孢桿菌HS09平皿挑取8個單菌落接入種子培養基(500 mL/2000 mL三角瓶)中,置于37℃,200 r·min-1搖床中培養16 h,按照體積2%的接種量移入體積200 L發酵罐(裝液量120 L)中,溫度37℃,罐壓0.04 Mpa,初始pH值6.8,攪拌轉速和通氣量控制方案如表3,發酵過程pH自然,培養24 h。每2 h取樣檢測,觀察芽孢形成情況,當芽孢率達到90%即發酵完成,放罐。
1.3.5 發酵液菌數的測定 (1)發酵液有效菌落數(cfu·mL-1)測定:采用平板菌落計數法檢測細菌總數;(2)發酵液芽孢數量測定:發酵液經80℃水浴加熱15 min后,用稀釋倒平板法檢測芽孢的產量[9]。(3)發酵液芽孢率快速計算:采用血細胞計數板計算發酵液總菌數與芽孢數,芽孢數與總菌數的百分比,即發酵液芽孢率。
2 結果與分析
2.1 碳源對枯草芽孢桿菌HS09發酵的影響
在碳源基礎發酵培養基中,分別加入葡萄糖、糖蜜、蔗糖、玉米淀粉各10 g·L-1,考察不同碳源對枯草芽孢桿菌HS09菌落數及芽孢產量的影響。從圖1可以看出,枯草芽孢桿菌對4種碳源都可以利用,但發酵后期菌體不易轉為芽孢。其中以葡萄糖作為碳源使用時,菌落總數最高,達到2.8×109 cfu·mL-1。因此,選擇葡萄糖作為枯草芽孢桿菌發酵的最優碳源。
2.2 氮源對枯草芽孢桿菌HS09發酵的影響
2.2.1 單一氮源優化 在氮源基礎發酵培養基中,分別加入硫酸銨、酵母粉、蛋白胨、豆粕粉、玉米粉各20 g·L-1,考察不同氮源對枯草芽孢桿菌HS09菌落數及芽孢產量的影響。從圖2可以看出,枯草芽孢桿菌發酵培養基中使用單一氮源,菌落總數整體不高,但不同氮源對枯草芽孢桿菌HS09菌落數及芽孢產量有明顯區別。以豆粕粉作為氮源時,菌落總數最高;其中以硫酸銨和玉米粉作為氮源時芽孢轉化率最好,分別達到80%和90%。
2.2.2 復合氮源優化 根據單一氮源試驗結果,在氮源基礎發酵培養基上,按照表1所列試驗方案,對不同氮源進行復配,考察復合氮源對枯草芽孢桿菌HS09菌落數及芽孢產量的影響。從圖3可以看出,使用復合氮源明顯提高枯草芽孢桿菌菌落總數,其中以(硫酸銨10 g·L-1+玉米粉15 g·L-1)和(硫酸銨5 g·L-1+豆粕粉5 g·L-1+玉米粉15 g·L-1)兩個組合菌落總數最高,均達到3.5×109 cfu·mL-1,芽孢轉化率分別為90%和75%。因此,選擇(硫酸銨10 g·L-1+玉米粉15 g·L-1)作為復合氮源,進行下一步正交試驗。
2.3 正交試驗優化
2.3.1 碳氮源正交試驗優化 根據碳源、單一氮源、復合氮源試驗結果,選取葡萄糖濃度為5 、10、15 g·L-1,硫酸銨濃度為2、5、8 g·L-1,玉米粉濃度為10、15、20 g·L-1為試驗條件進行正交試驗。以芽孢產量為指標,確定最優配比。從表4結果可知,影響枯草芽孢桿菌芽孢產量的主次因素是C>B>A,即玉米粉>硫酸銨>葡萄糖。枯草芽孢桿菌產芽孢培養基中最佳碳、氮源配比為A2B3C2,即葡萄糖10 g·L-1、硫酸銨8 g·L-1、玉米粉15 g·L-1。
推薦閱讀:農業經濟問題期刊級別