摘 要：植物種質資源是最重要的自然資源之一，也是植物育種的基礎。因此，研究植物種質資源保存技術對維持物種多樣性具有重要的現實意義。種質資源超低溫保存技術是指植物材料在液氮(-196 ℃)超低溫環境中可以長期保存，以保持其遺傳穩定性。本文對植物種質資源超低溫保存技術的起源、研究現狀、保存原理、具體方法、影響因素以及保存時間進行了歸納總結，并概述了其在草莓種質資源保存、脫毒苗培育及草莓再生苗遺傳穩定性方面的應用，提出其在發展的過程中凍存機理、材料凍存前后生理狀態和普適性技術體系方面的研究有待于進一步深入的觀點，并指出其在材料脫毒、抗性育種和遺傳轉化方面的廣闊發展前景，旨在為該技術在植物種質資源保存方面的深入研究和進一步拓展應用提供參考。

　　關鍵詞：種質資源;超低溫保存;草莓;研究進展

　　《山西農業科學》(月刊)創刊于1961年，由山西省農業科學院主辦。主要刊載生物技術、遺傳育種、耕作栽培、生理生化、資源與環境、植物保護、貯藏加工、畜牧獸醫等學科的研究報告、學術論文及綜合述評等。

　　植物種質資源是指包含各種遺傳物質的植物總稱，又被稱作遺傳資源或品種資源，包括栽培種、野生種和人工培育的各種植物的品種或品系[1]。隨著科學技術不斷進步，工業、農業、制造業需求不斷增長，人類掠奪式開采自然資源的方式嚴重威脅著植物種質資源的保存，目前全球有近十萬種植物(超過世界植物種類的1/3)瀕臨消失的邊緣，我國約有15%的植物瀕臨消失，并且全球氣候變暖使這種狀況更為惡化[2]。據估計，過去的3個世紀，物種絕跡速度被人為地提高了1 000多倍，大部分城市地區和栽培作物原產地的野生資源及其近緣種都瀕臨絕跡[3]。

　　植物種質資源保存方法分為3種：傳統保存法、離體保存法和超低溫保存法。傳統保存法分為原生境保存和異生境保存兩種[4]，可以較好地保存一些稀有或者即將滅絕的物種以及一些人們需求的特有物種，有助于人們對這些植物種質資源的開發和使用，但需要大量的土地和人力資源，消耗的成本較高，并且容易遭受各種病蟲害和自然災害的侵襲。離體保存法是利用植物細胞的全能性以及組織培養技術獲得細胞、組織、器官特定培養材料，通過改變培養材料生長的外部環境條件，使其生長速度降至最低限度，以達到保存種質的目的[5]，離體保存的材料不僅需要按期繼代，而且可能會發生染菌和褐化現象導致材料失活[6]，另外隨著培養時間的增加保存的材料可能會發生遺傳變異[7]。超低溫保存法一般是在液氮(-196 ℃)的超低溫條件下保存植物細胞、組織或器官，經過超低溫保存的植物材料能保持正常的細胞活性、全能性和遺傳穩定性，從而達到長時間保存種質資源的目的[8]。

　　本文主要從保存原理、研究現狀、具體方法、影響因素、保存時間幾個方面對植物種質資源超低溫保存技術進行歸納總結，并對其在草莓種質資源保存中的應用進行概括，旨在為該技術在植物種質資源保存方面的深入研究和進一步拓展應用提供參考。

　　1 種質資源超低溫保存技術

　　1.1 原理及現狀概述

　　植物種質資源超低溫保存指的是將植物的器官、細胞等材料置于液氮(-196 ℃)中使其始終處于超低溫的環境下進行保存的技術[9]。處于超低溫保存的植物材料暫停一切新陳代謝活動，經過解凍和恢復培養該材料再次具有正常細胞的生理活性和遺傳穩定性。在這一變化過程中，凍存的細胞內化學成分沒有發生本質性改變，僅在物理結構方面發生變化，不會改變細胞內遺傳物質以及相關代謝功能，因此在植物材料解凍后仍然能夠保持普通細胞的正常生理活性及遺傳穩定性，防止因長期繼代培育而造成的基因突變和染色體變異等，從而可以實現安全、有效的長期凍存植物材料[10]。

　　超低溫保存是目前唯一可以長期保存植物種質資源且不需要繼代培育的成本較低的技術，甚至被認為是實現植物種質資源長久、穩定保存的唯一途徑[11]。該技術的發展起源于對冷凍保護劑作用的了解，其保存過程中植物細胞需經歷劇烈的降溫和升溫變化，故超低溫保存成功的關鍵是避免降溫過程中細胞內冰晶生成以及溫度改變對細胞膜系統和代謝酶活性的影響[12]。1949年Polge發現甘油可以減輕超低溫對鳥類精子的凍存破壞，1959年二甲基亞砜(DMSO)開始被作為冰凍保護劑[13]。Nag等[14]于1973年首次報道了利用超低溫保存技術成功凍存蘿卜懸浮細胞的研究。自此以后，經過近四十年的探索和發展，從開始相對落后的快速降溫冷凍法、逐漸降溫冷凍法[15]，至1981年Fahy首次提出植物細胞玻璃化(即在比較慢的冷卻速率下利用高濃度的冷凍保護劑溶液使植物細胞進入玻璃化狀態)的概念[16]，提升發展為玻璃化法[17]、包埋玻璃化法[18]、小液滴玻璃化法[15]等，使超低溫保存技術日趨完善。截止到2018年，我國已建成1座國家種質資源長期庫、1座復份庫、10座中期庫及種質資源信息系統，保存48.1萬余份的種質資源，保存數量位居世界第二，為作物科學和遺傳育種提供了雄厚的物質基礎[19]。

　　1.2 方 法

　　目前，植物莖尖、芽和分生組織的超低溫保存方法主要有如下5種[20]。

　　1.2.1 慢凍法 也稱為二步冷凍法，以緩慢的速度連續降溫到-196 ℃，或者將材料以0.5～2.5 ℃·min-1的降溫速度持續降溫到-30～-40 ℃，然后再將莖尖直接浸沒液氮中;或者在-30～-40 ℃預凍一段時間，然后再將莖尖浸沒于液氮中。

　　1.2.2 快凍法 即在預處理溫度下，將材料徑直浸沒于液氮凍存。

　　1.2.3 包埋脫水法 首先是將材料用海藻酸鈣包埋，然后將包埋后的保存材料放在含有高濃度的培養基上進行預培養，之后用通風設備或硅膠對包埋小珠進行干燥脫水處理后投入液氮凍存。

　　1.2.4 玻璃化法 在材料經過預培養后，用高濃度的玻璃化液在常溫或0 ℃條件下進行加載處理和脫水處理，然后再將莖尖浸沒于液氮中凍存。

　　1.2.5 包埋玻璃化法 先是用海藻酸鹽包埋材料，然后用玻璃化液進行誘導脫水，最后將其直接浸沒于液氮凍存。

　　1.3 影響因素

　　超低溫保存材料能否成功是由材料特性、預培養方法、冷凍保護劑、冷凍方法等因素共同決定的[9]。

　　1.3.1 材料特性 因植物種類不同其基因型不同，同一植物的不同部位或者相同植物相同部位的不同大小其生理活性也不同，導致冷凍成效差別較大，因此植物材料的選擇非常重要[21]。例如超低溫保存蘋果莖尖時，6周齡時成活率只有27% ，而29周齡時成活活率達到86%[22-23];張玉芹等[24]研究發現，體積較小的百合組培球莖尖凍存成活率比較高但之后的恢復培育比較難，而體積較大的百合組培球莖尖成活率較低但之后的恢復培育較為容易。

　　1.3.2 預培養方法 主要目的是減小細胞內自由水含量，有低溫鍛煉和干燥處理兩種方法[9]。低溫鍛煉可提高細胞液的滲透勢和植株內的α-亞氨基酸和聚胺的濃度，增強材料細胞的抗寒性，故預培養可在相當程度上增加植物材料的成活率[25]。陳加利等[26]通過對不同低溫鍛煉時間對扁桃莖尖存活率的影響進行研究，結果表明，以4周這個時間點為界限，隨著低溫(4 ℃)鍛煉時間的延長，扁桃莖尖經過超低溫保存后的成活率呈現先增加后下降的變化趨勢，而扁桃莖尖沒有經過低溫鍛煉就進行超低溫保存，其成活率為0。干燥處理是使植物細胞的含水量居于一個合適保存水平，防止植物材料細胞內的水分在冷凍過程中生成冰晶對植物造成破壞[27]。

　　1.3.3 冷凍保護劑 可以在一定程度上減少超低溫對植物材料造成的傷害，冷凍保護劑可以分為滲透保護劑和非滲透保護劑[28]。滲透保護劑有甲醇、乙二醇、丙二醇、甘油、二甲基亞砜等化學試劑，分屬小分子物質，容易穿過細胞膜和細胞液中的水分子融合，可阻止凍存材料在冷凍和化凍時因過度脫水而死亡[29]。其中二甲基亞砜自身就為毒性物質，用保護劑處理材料時會對其在一定程度上造成傷害，所以在超低溫保存時應合理選擇冷凍保護劑的種類和用量，及其處理的時間和溫度，否則冷凍保護劑就起不到應有的保護作用[30]。非滲透保護劑有聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、蔗糖、聚乙二醇等，分屬大分子物質，不能穿過細胞，但在超低溫保存之前，能優先融合溶液中的水分子[29]。

　　1.3.4 冷凍方法 不同的冷凍方法具有不一樣的降溫速度，而降溫速度的快慢又會影響超低溫保存后植物材料的成活率，所以不同植物材料的最優降溫速度又不一樣，器官水平上的植物材料則由植物實現低溫鍛煉的強度決定冷凍方法，細胞水平上的植物材料主要由細胞膜的通透性能決定冷凍方法[25]。