摘要：研究了不同質量濃度(4 μg/mL，8 μg/mL，12 μg/mL和16 μg/mL)的吡咯喹啉醌(PQQ)對水芹種子萌發過程的影響，結果表明：在PQQ的作用下，水芹種子的發芽率、發芽勢、發芽指數和呼吸強度均隨著PQQ質量濃度的增加而提高，其中質量濃度為16 μg/mL的PQQ浸種效果最佳，PQQ具有促進水芹種子萌發的生理效應;PQQ的作用對水芹種子中淀粉酶活力影響不大，對脂肪酶和過氧化物酶活力有著明顯的增強作用.
關鍵詞：吡咯喹啉醌;水芹;種子萌發;生理效應
《工程與試驗》(季刊)創刊于1961年，由中國儀器儀表學會試驗機分會、長春試驗機所主辦。本刊秉承“宣傳貫徹科學技術是第一生產力的思想，介紹新的科技成果，傳播新的科技信息，普及科學知識、科學方法和科學思想，促進生產力的發展”的辦刊宗旨;奉行“科學、嚴謹、務實、求真”的辦刊方針。
0 引言
1960年代，一種新型維生素吡咯喹啉醌PQQ(pyrroloquinoline quinone)被科學家發現，它廣泛存在于水果、蔬菜、谷物等食品中，是許多細菌中甲醇脫氫酶、葡萄糖脫氫酶GDH(glucosedehydrogenase)、甘油脫氫酶等的輔酶，能夠參與呼吸鏈電子傳遞[1-2].但是，只有部分革蘭氏陰性菌能夠自身合成PQQ，而人類與動植物主要從外界獲取該維生素[3-4].
研究表明，PQQ可以縮短植物生長停滯期，促進植物細胞新陳代謝和生長[5].
張鵬等[6]研究發現，在小麥植株生理代謝調節過程中，PQQ可增加葉綠素含量，使光合速率增加，并提高硝酸還原酶和谷氨轉氨酶活性，從而減少穗部小花敗育，提高小麥結實率.
匡煒等[7]的研究表明，PQQ能有效提高湘早秈45號水稻的每穗實粒數和結實率，減少每穗空粒數，對水稻增產有促進作用.另外，PQQ作為GDH
的氧化還原輔因子，可將葡萄糖轉化為葡萄糖酸，溶解不溶性磷酸鹽到土壤中，促進植物吸收生長[8].PQQ還可以促進玫瑰紅蘋果和紅富士蘋果花粉萌發和花粉管生長，但濃度過高則會減弱效果，甚至產生抑制效應，且紅富士蘋果較玫瑰紅蘋果更為敏感，當PQQ濃度高于1 μmol/L時即產生明顯的抑制效應[9].
總之，PQQ能促進某些植物生長，但其對水芹種子的萌發過程是否有影響尚不明確.本文擬以水芹種子為原料，研究不同質量濃度的PQQ對水芹種子萌發的影響，并進一步研究PQQ的作用對種子萌發過程中關鍵酶(淀粉酶、脂肪酶和過氧化物酶)活性的影響，以明晰PQQ對水芹種子萌發的生理效應和作用機制.
1 材料與方法
1.1 材料與試劑
實驗材料：水芹種子，購于鄭州市種子公司;吡咯喹啉醌(色譜純)，由瀚香生物科技公司提供.
實驗試劑：3，5-二硝基水楊酸、甲苯、乙醇，天津市致遠化學試劑有限公司產;愈創木酚，北京索萊寶科技有限公司產;橄欖油、乙醚，生工生物工程上海股份有限公司產;百里香酚酞，廣東光華化學廠有限公司產.以上試劑均為分析純.
1.2 儀器與設備
HH-S型數顯恒溫水浴鍋，江蘇省金壇市醫療器械有限公司產;SHP-250型恒溫光照培養箱，上海鴻都電子科技有限公司產;2300型UV-分光光度計，尤尼克(上海)有限公司產;Sartorius PB-10型pH酸度計，上海市實驗儀器總廠產.
1.3 實驗方法
1.3.1 水芹種子萌發
取大小均勻的水芹種子，將其分為5組，每組20粒.用質量分數1%的NaClO浸種20 min，蒸餾水洗凈，再用不同質量濃度的PQQ(4 μg/mL，8 μg/mL，12 μg/mL和16 μg/mL)室溫浸種48 h，用3 mL不同質量濃度的PQQ溶液浸潤濾紙，并將種子點播吸附在濾紙上，置于恒溫培養箱中于25 ℃下光照培養.其間補加相應質量濃度的PQQ以保持濾紙的濕潤[10].實驗持續5 d，每d記錄正常發芽種子數.按以下公式計算水芹種子的各種活力指標.
發芽率=種子發芽數供實驗種子數×100%
1.3.2 呼吸強度測定
呼吸強度，是植物體新陳代謝強弱的一個重要指標，它是指單位面積或單位質量的植物體，在單位時間內所吸收的O2或釋放的CO2量或損失的干重.
用飽和堿液吸收一定量的植物材料在單位時間內放出的CO2，再用標準酸液滴定，即能測得植物的呼吸強度.
參照李海霞等[11]的方法，用上述不同質量濃度的PQQ對種子進行浸種處理，實驗持續 5 d，每d對呼吸速率進行測定，然后按以下公式計算呼吸強度.
其中，V0為空白滴定用去的草酸量/mL，V1為樣品滴定用去的草酸量/mL，W為樣品鮮重/g，T為測定時間/h.
1.3.3 酶活力測定
1.3.3.1 淀粉酶活力測定
參照張志鵬[12]的方法，采用3，5-二硝基水楊酸還原法，每12 h對不同質量濃度PQQ浸種處理的水芹種子中淀粉酶活性進行測定，實驗持續3 d。酶活力定義為每g樣品在單位時間內生成還原糖(麥芽糖)的量.
麥芽糖標準曲線的制作：分別配制0 mg/mL，0.2 mg/mL，0.4 mg/mL，0.6 mg/mL，0.8 mg/mL 和1.0 mg/mL的麥芽糖標準溶液，吸取標準溶液1.0 mL于刻度試管中，加3.0 mL 二硝基水楊酸(DNS)試劑，搖勻，沸水浴10 min后經流水冷卻，加蒸餾水定容至15 mL，在520 nm 的波長下比色測定吸光度值，并建立通過吸光度值求麥芽糖質量濃度的回歸方程.
淀粉酶液制備：稱取1 g經不同質量濃度PQQ溶液作用的水芹種子于研缽中，加入5 mL蒸餾水，研磨勻漿后倒入離心管中，再用10 mL蒸餾水分次將殘渣洗入離心管.在室溫下靜置 20 min 制備提取液，每隔5 min攪動1次，使其充分提取.在4 ℃條件下3000 r/min低溫離心10 min，取上清液加蒸餾水定容至100 mL后搖勻，即為淀粉酶原液，用于α-淀粉酶活力測定.取淀粉酶原液10 mL，用蒸餾水定容至 50 mL 后搖勻，即為淀粉酶稀釋液，用于淀粉酶活力的測定.
1.3.3.2 脂肪酶活力測定
脂肪酶可以分解種子中貯藏的營養物質，為種子萌發的異養階段提供能量[13].
參照GB/T 5523—2008[14]，稱取2 g水芹種子于研缽中，加入1.0 mL橄欖油，混勻，加入5.0 mL pH=7.5的磷酸緩沖液，研磨后轉入100 mL錐形瓶中，用5.0 mL蒸餾水洗凈研缽，洗液全部轉入錐形瓶中，加3滴甲苯，置于30 ℃恒溫箱內，保溫24 h后取出.加入V(乙醇)GA6FAV(乙醚)=4GA6FA1的混合液50 mL，靜置5 min，加入0.5 mL質量分數為1%的百里香酚酞乙醇溶液指示劑，用0.2 mol/L氫氧化鈉乙醇溶液滴定至終點(淺藍色)，記錄用去堿液的體積(V2).另外稱取2 g相應質量濃度試樣做對照試驗，除不用 30 ℃ 保溫24 h外，其余操作同上，記下用去的堿液體積(V3).
每12 h對不同質量濃度PQQ作用的水芹種子進行脂肪酶活性測定，實驗持續 3 d.
其中，V2為試樣滴定用去的堿液體積/mL，V3為對照試驗用去的堿液體積/mL，N為實際堿液質量濃度/(mol·L-1)，W1為試樣質量/g，M為試樣水分質量分數/%.
1.3.3.3 過氧化物酶活力測定
過氧化物酶是以過氧化氫為電子受體催化底物氧化的酶，與呼吸作用、光合作用、生長素的氧化等都有關系[15].
分別取0.5 g經不同質量濃度PQQ作用的水芹種子于研缽中，加入液氮后充分研磨，再加入3.0 mL磷酸緩沖液，預冷5 min，7000 r/min 離心15 min，上清液為粗酶提取液，提取后低溫保存待用.
酶活力測定的反應體系為：0.05 mol/L磷酸緩沖液2.9 mL;2%的H2O2 1.0 mL;0.05 mol/L 愈創木酚 1.0 mL;酶液0.1 mL.用加熱煮沸5 min的酶液作為對照.反應體系加入酶液后，立即于34 ℃水浴保溫30 s，在 470 nm 波長處進行比色，開始記錄數據，然后每 0.5 min 記錄一次吸光度值，共測2 min.
以每min A470的變化值0.01為一個相對酶活單位U，計算植物組織內過氧化物酶活力的大小.每12 h對經不同質量濃度PQQ作用的水芹種子進行過氧化物酶活力測定，實驗持續3 d.
其中，Vt為酶液的總體積/mL，ΔA470為吸光度的變化值，t為間隔時間/min，Vs為測定時取用的酶液體積/mL，W2為粒種子的質量/g.
2 結果與分析
2.1 不同質量濃度的PQQ對水芹種子萌發的影響
水芹種子萌發實驗結果如圖1所示.由圖1可知，以胚根突破種皮1 mm作為種子發芽標準(圖1a))，萌發初期(即培養期的前96 h)組間差異不明顯，水芹種子基本不發芽或者剛剛露白(圖1b)).圖2為中后期水芹種子萌發情況.由圖2可知，在4種質量濃度范圍內，PQQ質量濃度越高，對種子萌發的促進作用越明顯.在質量濃度為16 μg/mL的PQQ作用下，種子萌發到120 h時的發芽率為43.4%，對照組發芽率為33%;至192 h時的發芽率提升至85%，對照組發芽率為42.6%.在其他3種質量濃度的PQQ作用下的水芹種子的發芽率均高于對照組，低于在質量濃度為16 μg/mL的PQQ作用下的發芽率.由此可見PQQ能有效促進水芹種子的萌發.
在不同質量濃度的PQQ作用下水芹種子的發芽指數、發芽率和發芽勢如圖3和圖4所示.由圖3和圖4可知，水芹種子在萌發的第 8 d，對照組的發芽率為56.7%，在質量濃度為 8 μg/mL 的PQQ作用下的種子發芽率為70%;在質量濃度為16 μg/mL的PQQ作用下的種子發芽率最高，為86.7%.以萌發第5 d計算發芽勢，在質量濃度為0～16 μg/mL的PQQ作用下，種子的發芽勢從33.3%提高到43.3%.這表明隨著PQQ質量濃度的提高，水芹種子發芽勢逐漸增大，種子活力提高，發芽率隨之提高.
