【摘要】 目的 探索高頻彩色多普勒超聲與實(shí)際游標(biāo)卡尺測量腫瘤的相關(guān)性。方法 將0.10 mL 2×106 DU145細(xì)胞懸液注射到裸鼠前列腺包膜下。細(xì)胞注射后第2周至第5周使用高頻彩色多普勒超聲測量裸鼠腫瘤橫徑與縱徑。麻醉狀態(tài)下解剖裸鼠，游離腫瘤，游標(biāo)卡尺測量腫瘤橫徑與縱徑。腫瘤放入1.3 mol?L-1甲醛中固定，HE染色。結(jié)果 高頻彩色多普勒超聲測量的橫徑與使用游標(biāo)卡尺測量的橫徑相比，Pearson與Spearman相關(guān)系數(shù)分別是0.996(P<0.001)與0.964(P<0.001);高頻彩色多普勒超聲測量的橫徑與使用游標(biāo)卡尺測量的縱徑相比，Pearson與Spearman相關(guān)系數(shù)分別是0.988(P<0.001)與0.898(P<0.01)。結(jié)論 高頻彩色多普勒超聲可精確地監(jiān)測裸鼠前列腺原位種植腫瘤的生長。

　　【關(guān)鍵詞】 高頻彩色多普勒超聲 原位種植 前列腺腫瘤 動(dòng)物模型

　　Abstract: Objective To investigate the growth of tumor of dependablity between ultrasonography and vernier caliper.Methods Tumor cell were implanted into capsula prostatica of nude mice with 0.1 mL 2×106 DU145 cell suspensions.And detected the tumor′s transverse diameter and vertical diameter by high frequency color doppler ultrasound in the 2nd,3rd,4th,5th week after injection.The nude mice were dissected under narcotism,and dissociated the tumor,mearsured transverse diameter and vertical diameter of tumor by vernier caliper.Then the tumor was fixed in 1.3 mol?L-1 formaldehyde and stained by HE.Results The result of tumor measured by ultrasonography and vernier caliper had a strong correlation:the coefficient of correlation of Pearson and Spearman were 0.996(P<0.001) and 0.964(P<0.001) in transversal diameter,0.988(P<0.001) and 0.898(P=0.006) in vertical diameter.Conclusion High frequency color doppler ultrasound can monitor the growth of orthotopic prostate tumor of nude mouse punctually.

　　Key words: high frequency color Doppler ultrasound;orthotopic implantation;prostate tumor;animal model

　　當(dāng)今進(jìn)行抗腫瘤藥物的臨床前實(shí)驗(yàn)，常使用裸鼠或重癥聯(lián)合免疫缺陷鼠(severe combined immune deficiency，SCID)。在其皮下種植腫瘤而建立動(dòng)物模型，給予抗腫瘤藥物干預(yù)，并通過游標(biāo)卡尺測量腫瘤體積的變化，來評價(jià)抗腫瘤藥物的治療效果。但是對于前列腺原位種植腫瘤，由于腫瘤生長在腹腔內(nèi)，位置較深，不可以使用卡尺直接進(jìn)行體表測量。本研究采用高頻彩色多普勒超聲對每只裸鼠原位種植腫瘤進(jìn)行測量，隨即解剖裸鼠，顯露腫瘤進(jìn)行卡尺測量，比較超聲與實(shí)際卡尺測量的相關(guān)性。

　　1 材料與方法

　　1.1 材料 BALB/C雄性裸鼠,6～8周齡，體質(zhì)量22～24 g，由中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，并在北京大學(xué)人民醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室無特定病原體動(dòng)物(Specific Free Animal,SPF)條件的層流架內(nèi)飼養(yǎng)，飲水自由攝入。雄激素非依賴性前列腺癌細(xì)胞系DU145由北京大學(xué)第一醫(yī)院泌尿外科研究所饋贈(zèng)，北京大學(xué)人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)。高頻彩色多普勒超聲(GE公司LOGIW9高頻彩色多普勒超聲)測量腫瘤由北京大學(xué)人民醫(yī)院超聲科完成。腫瘤標(biāo)本的甲醛固定，石蠟包埋、切片，HE染色在北京大學(xué)人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室完成。

　　1.2 方法

　　1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 復(fù)蘇凍存的前列腺癌細(xì)胞系DU145，用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清(杭州四季青公司)的1640培養(yǎng)液(北京天潤善達(dá)公司)在37 ℃、50 mL?L-1CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)。2.5 g?L-1的胰酶與體積分?jǐn)?shù)0.02%的EDTA(杭州吉諾生物公司)消化傳代培養(yǎng)。腫瘤細(xì)胞貼壁生長。由于DU145細(xì)胞系生長迅速，應(yīng)注意每天給細(xì)胞換液。

　　1.2.2 原位種植模型建立 當(dāng)腫瘤細(xì)胞生長至對數(shù)增長期，胰酶消化，1000 r?min-1離心5 min(無錫瑞江牌離心機(jī)，型號(hào)RJTDL40B),重新懸于無血清的1640培養(yǎng)液中，調(diào)整細(xì)胞密度，臺(tái)盼藍(lán)染色選擇細(xì)胞存活率大于90%的細(xì)胞懸液。繼續(xù)用無血清的1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度2×107 ?mL-1。裸鼠采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.7%戊巴比妥鈉0.01 mL?g-1腹腔注射麻醉。取仰臥位，膠帶固定四肢，酒精消毒皮膚，取下腹部低位橫切口，小心分離皮下組織、脂肪、肌肉層后進(jìn)入腹腔，游離膀胱至頸部，前列腺則在膀胱頸背部腹膜下。用1 mL顯微注射器抽取0.10 mL細(xì)胞懸液，把細(xì)胞吹打均勻，經(jīng)腹膜進(jìn)針，一次性注射到前列腺包膜下，且無細(xì)胞懸液溢出，前列腺部位立即鼓起1個(gè)小包，標(biāo)志注射成功。棉簽輕微按壓片刻，80號(hào)縫線單層縫合，關(guān)閉腹腔。本次實(shí)驗(yàn)共種植11只裸鼠，3只由于麻醉及手術(shù)意外死亡。

　　1.2.3 高頻彩色多普勒超聲監(jiān)測 8只裸鼠按照種植先后順序編號(hào)為1～8號(hào)，第2周至第5周，按順序每周取出2只做高頻彩色多普勒超聲監(jiān)測。裸鼠采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.7%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，使用12～16MHz的超頻探頭對前列腺部位監(jiān)測。在充盈膀胱的低密度回聲襯托下，清晰顯示出前列腺腫瘤。記錄腫瘤的橫徑與縱徑、腫瘤血流、內(nèi)部回聲、組織壞死、局部浸潤以及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況。

　　1.2.4 超聲與實(shí)際卡尺測量腫瘤的相關(guān)性 每次對裸鼠前列腺腫瘤超聲監(jiān)測時(shí)，由2名超聲科大夫分別對同1裸鼠腫瘤橫徑與縱徑分別測量3次完成，并計(jì)算出3次測量的平均值。超聲測量完成后在麻醉狀態(tài)下解剖裸鼠，開腹顯露前列腺腫瘤，研究者在未知超聲測量結(jié)果的情況下，使用游標(biāo)卡尺測量腫瘤橫徑與縱徑3次，并計(jì)算出3次測量的平均值。腫瘤體積計(jì)算方式大多數(shù)采用[1]，腫瘤體積=短徑2×長徑×0.5236。

　　1.2.5 HE染色 腫瘤組織在1.3 mol?L-1甲醛中固定24 h，石蠟包埋固定并做連續(xù)性切片。蘇木素-伊紅染色、顯微鏡下觀察。

　　1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 計(jì)量資料以±s表示。使用SPSS 13.0軟件得出超聲與實(shí)際游標(biāo)卡尺測量腫瘤橫徑的Pearson與Spearman相關(guān)系數(shù)，超聲與實(shí)際游標(biāo)卡尺測量腫瘤縱徑的Pearson與Spearman相關(guān)系數(shù)。

　　2 結(jié)果

　　2.1 原位模型建立 8只裸鼠于種植后第2周均可觸摸到綠豆大小硬結(jié)，質(zhì)硬、活動(dòng)度差，裸鼠精神狀態(tài)尚佳。以HE染色證實(shí)腫瘤是否種植成功，結(jié)果表明第8號(hào)裸鼠“腫瘤”為囊腫，成瘤率87.5%。當(dāng)進(jìn)行相關(guān)分析時(shí)，采用7只成瘤鼠。

　　2.2 高頻彩色多普勒超聲監(jiān)測與實(shí)際測量結(jié)果 8只裸鼠于種植后第2周至第5周，按順序每周取出2只做高頻彩色多普勒超聲監(jiān)測。7只裸鼠使用超聲測量的橫徑與使用游標(biāo)卡尺測量的橫徑相比，Pearson與Spearman相關(guān)系數(shù)分別是0.996(P<0.001)與0.964(P<0.001);7只裸鼠使用超聲測量的橫徑與使用游標(biāo)卡尺測量的縱徑相比，Pearson與Spearman相關(guān)系數(shù)分別是0.988(P<0.001)與0.898(P<0.01)。超聲測量與游標(biāo)卡尺測量呈高度正相關(guān)。經(jīng)超聲測量第6號(hào)與第7號(hào)裸鼠腫瘤體積分別為(119.9±8.9)mm3與(126.7±9.6)mm3，均>50 mm3，其余4只裸鼠腫瘤體積均<50 mm3，見表1。7只成瘤鼠超聲均在充盈膀胱液性暗區(qū)襯托下，于膀胱頸部可清晰地顯示種植腫瘤,腫瘤呈低回聲，邊界清晰。其中4號(hào)成瘤鼠超聲測量腫瘤橫徑是2.6 mm，縱徑是2.1 mm。見圖1。該裸鼠前列腺原位種植腫瘤、精囊、膀胱取出在體外的照片，見圖2。表1 裸鼠前列腺原位種植腫瘤使用高頻彩色多普勒超聲與實(shí)際游標(biāo)卡尺測量的結(jié)果

　　2.3 HE染色結(jié)果 所有成瘤鼠可見個(gè)別前列腺樣結(jié)構(gòu);腫瘤細(xì)胞圍繞前列腺腺泡生長，為低分化腺癌結(jié)構(gòu)，腫瘤細(xì)胞異形性明顯,極向消失，排列紊亂;胞核大小不一、核大深染,并可見較多核分裂像;有巨核細(xì)胞,間質(zhì)成分少，見圖3。

　　3 討論

　　人前列腺癌動(dòng)物模型是研究前列腺癌發(fā)病機(jī)制、腫瘤與宿主關(guān)系、癌腫侵襲與轉(zhuǎn)移過程和治療措施有效性不可缺少的理想實(shí)驗(yàn)工具,裸鼠因其免疫缺陷特性成為建立人類腫瘤動(dòng)物模型的最佳載體.以往制作前列腺癌裸鼠模型時(shí)多選擇皮下作為荷瘤部位,接種方便、易于觀察,但是根據(jù)Paget的“種子與土壤”( Seed and Soil)學(xué)說,腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移依賴于一個(gè)合適的微環(huán)境,因此原位種植較皮下接種具有更高的致瘤率，且皮下移植瘤模型并不能很好地模擬前列腺癌在人體內(nèi)的自然生長過程以及許多生物學(xué)行為,而原位種植不僅使腫瘤細(xì)胞獲得了更接近人體內(nèi)的生長微環(huán)境,而且其中豐富的內(nèi)源性生長因子,能夠提高移植成功率,并形成與臨床相似的轉(zhuǎn)移模式[2]。當(dāng)今抗腫瘤藥物的臨床前試驗(yàn)主要使用皮下種植腫瘤，因?yàn)槠は路N植腫瘤可以方便地使用卡尺測量其直徑或體積，觀察藥物作用的效果。但是前列腺皮下種植腫瘤不可以進(jìn)行抗血管藥物以及抗轉(zhuǎn)移性腫瘤藥物的臨床前試驗(yàn)[3]。

　　在臨床腫瘤的治療中，患者對抗癌藥物治療的效果可以通過腫瘤在影像學(xué)上的表現(xiàn)反映出來。近年影像學(xué)技術(shù)包括超聲、CT、MRI以及一些顯微成像技術(shù)發(fā)展非常迅速[45]，一些研究者利用MRI可以精確地發(fā)現(xiàn)小鼠膀胱內(nèi)的微小腫瘤，并測量出腫瘤的體積，可以很好地做出縱向監(jiān)測，但是MRI監(jiān)測價(jià)格昂貴、需要花費(fèi)很長的時(shí)間限制了其在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用。高頻彩色多普勒超聲由于在技術(shù)上的簡便性、非侵襲性、費(fèi)用低與操作時(shí)間短，在鼠類原位種植腫瘤的監(jiān)測中優(yōu)于MRI。在前列腺癌動(dòng)物模型中也有研究者使用經(jīng)直腸超聲監(jiān)測[68]，但是需要特殊的腔內(nèi)小探頭。本次實(shí)驗(yàn)使用經(jīng)腹部超聲清楚顯示出腫瘤，并可以精確測量腫瘤體積，觀察腫瘤的形態(tài)、內(nèi)部回聲、彩色血流、內(nèi)部壞死、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況。

　　本次實(shí)驗(yàn)過程中，一裸鼠腫物的高頻彩色多普勒超聲監(jiān)測發(fā)現(xiàn)在膀胱的液性暗區(qū)襯托下，疑似原位種植腫瘤。最后HE染色結(jié)果是一囊腫。所以高頻彩色多普勒超聲不可以完全確定腫瘤是否種植成功，最后在判斷結(jié)果時(shí)要以HE染色為標(biāo)準(zhǔn)。

　　在抗腫瘤藥物的臨床前研究中，有2種給藥方式。一種是腫瘤細(xì)胞種植當(dāng)天或稍后給予藥物，稱為腫瘤生長的抑制研究;另一種是當(dāng)種植腫瘤生長到50～200 mm3給與藥物，稱為腫瘤生長的推遲研究。推遲研究提供的證據(jù)優(yōu)于抑制研究[9]。裸鼠前列腺原位種植腫瘤模型中，當(dāng)腫瘤生長到體積為50 mm3左右時(shí)，也許已經(jīng)超過該腫瘤的指數(shù)增長期，此時(shí)將給予藥物容易出現(xiàn)假陽性結(jié)果。本次實(shí)驗(yàn)共有5只腫瘤體積在50 mm3以下，7只腫瘤使用超聲與實(shí)際卡尺測量均呈高度正向關(guān)。說明高頻彩色多普勒超聲可以很好地描述縱向腫瘤的生長情況，尤其在腫瘤生長的早期。本實(shí)驗(yàn)將進(jìn)一步使用高頻彩色多普勒超聲繪制每只裸鼠前列腺原位種植腫瘤的生長曲線，找出腫瘤的指數(shù)生長期或者體積倍增時(shí)間，為臨床前抗腫瘤藥物的干預(yù)治療提供合適的時(shí)間窗。高頻彩色多普勒超聲也可以準(zhǔn)確地描述出腫瘤血供、壞死、浸潤、轉(zhuǎn)移，是一種很好的、非侵襲性的監(jiān)測工具，也可以應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因鼠前列腺癌模型的縱向監(jiān)測。

　　【參考文獻(xiàn)】

　　[1] Janik P,Briand P,Hartmann NR.The effect of estroneprogesterone treatment on cell proliferation kinetics of hormonedependent GR mouse mammary tumors[J].Cancer Res,1975,35(12):36983704.

　　[2] 羅 勇，張林琳，賀大林.裸鼠前列腺原位模型的建立[J].第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2005,26(19):17971799.

　　[3] Kelland LR.Of mice and men:values and liabilities of the athymic nudemouse model in anticancer drug development[J].Eur J Cancer,2004,40(6):827836.

　　[4] Mazurchuk R,Glaves D,Raghavan D.Magnetic resonance imaging of response to chemotherapy in orthotopic xenografts of human bladder cancer[J].Clin Cancer Res,1997,3(9):16351641.

　　[5] Weissleder R.Scaling down imaging molecular mapping of cancer in mice[J].Nat Rev Cancer,2002,2(1):1118.

　　[6] Wirtzfeld LA,Wu G,Bygrave M,et al.A new threedimensional ultrasound microimaging technology for preclinical studies using a transgenic prostate cancer mouse model[J].Cancer Res,2005,65(14):63376345.

　　[7] Kusaka N,Nasu Y,Arata R，et al.Transrectal ultrasound for monitoring murine orthotopic prostate tumor[J].The Prostate,2001,47(2)：118124.

　　[8] Kraaij R,Van Weerden WM,De Ridder CM,et al.Validation of transrectal ultrasonographic volumetry for orthotopic prostate tumours in mice[J].Lab Anim,2002,36(2):165172.

　　[9] Teicher BA.Tumor models for efficacy determination[J].Mol Cancer Ther,2006,5(10):24352443.

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