【摘要】目的：探討針灸治療不完全性截癱對bFGF陽性表達(dá)的影響及其對脊髓損傷修復(fù)的意義。方法：采用不完全性截癱兔模型，于傷后6 h、7 d、15 d取損傷脊髓組織3 mm長，用免疫組織化學(xué)S-P法染色，并用美國產(chǎn)Optimas6.51彩色圖象分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析。結(jié)果：造模后，bFGF表達(dá)主要在脊髓白質(zhì)部位，并于第7 d開始針灸組脊髓白質(zhì)灰質(zhì)陽性顆粒表達(dá)明顯下降，出現(xiàn)低谷，而模型組明顯上升，第15 d均稍有恢復(fù)。結(jié)論：針灸作用于截癱早期脊髓損傷的機(jī)理為對內(nèi)源性bFGF的抑制，7 d時明顯降低BFGF合成釋放，達(dá)到抗瘢痕形成，抗粘連作用，從而減輕繼發(fā)性損害有關(guān)，為脊髓功能恢復(fù)提供了有利條件。本文選自：《針灸臨床雜志》是由中華人民共和國新聞出版總署、正式批準(zhǔn)公開發(fā)行的優(yōu)秀期刊。自創(chuàng)刊以來，以新觀點、新方法、新材料為主題，堅持"期期精彩、篇篇可讀"的理念。針灸臨床雜志內(nèi)容詳實、觀點新穎、文章可讀性強(qiáng)、信息量大，眾多的欄目設(shè)置，針灸臨床雜志公認(rèn)譽為具有業(yè)內(nèi)影響力的雜志之一。針灸臨床雜志并獲中國優(yōu)秀期刊獎，現(xiàn)中國期刊網(wǎng)數(shù)據(jù)庫全文收錄期刊。

　　【關(guān)鍵詞】針灸;脊髓損傷/脊髓損傷修復(fù);bFGF陽性表達(dá)

　　截癱尤其是不完全性截癱已成為臨床的常見病和疑難病，其主要原因是傷后繼發(fā)損害不斷加重，發(fā)展最終導(dǎo)致不可逆改變。針灸對其療效確切，以成為截癱恢復(fù)的重要手段之一。堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)是一個多功能因子，能刺激血管生成和神經(jīng)元的增殖、分化。其神經(jīng)營養(yǎng)作用包括促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞再生和存活，保護(hù)受損神經(jīng)細(xì)胞抵御興奮性氨基酸的神經(jīng)毒作用[1]。隨著研究的深入，它對神經(jīng)系統(tǒng)生長、發(fā)育中的作用越來越受到重視。我們對針刺不完全性截癱兔的損傷脊髓部位的bFGF陽性表達(dá)作了動態(tài)對比觀察，以探討針灸治療截癱的機(jī)理。報道如下。

　　1　材料與方法

　　1.1　材料

　　①實驗動物與分組：由湖南中醫(yī)學(xué)院日本大耳白兔飼養(yǎng)中心，提供健康雄性日本大耳白兔70只，體重2.0～2.5 kg。隨機(jī)分為非脊髓損傷組，造模損傷6 h組、7 d組、15 d組，針刺6 h組、7 d組、15 d組，每組10只;②兔不完全性截癱模型的制備：兔不完全性截癱模型采用壓迫法[2]，造成不完全性脊髓損傷，正常對照組與模型組、針灸治療組一樣常規(guī)麻醉，顯露第七腰椎間孔切斷黃韌帶，插入麻醉導(dǎo)管膠囊，并用皮膚尾線固定，但不注入典必樂，不予壓迫，24 h后拔掉導(dǎo)管;③模型組不行治療，針灸治療組在模型形成后6 h內(nèi)即開始針灸治療。

　　1.2　針灸治療方法

　　1.2.1　頭皮針刺激法

　　頭針運動區(qū)、感覺區(qū)，沿頭皮分三段刺入帽狀腱膜下，施小幅度高頻率捻轉(zhuǎn)手法，再配以電針(不完全性截癱多表現(xiàn)為遲緩性癱，采用斷續(xù)波)增加刺激量。每次25 min，1次/d。

　　1.2.2　針灸督脈方法：

　　在損傷脊髓平面上、下兩椎體棘間隙各進(jìn)一針至硬膜外，捻轉(zhuǎn)勿提插，得氣后通以微量電流[波形同(1)]。損傷早期可采用隔姜灸督脈損傷部位。每次25 min，1次/d。

　　1.2.3　配合體針刺

　　取“環(huán)跳”“委中”“殷門”“涌泉”“次髎”等穴。針刺行平補(bǔ)平瀉法，留針25 min，1次/d。

　　1.3　標(biāo)本采集及觀察指標(biāo)

　　1.3.1　在模型形成6 h、7 d、15 d時，空氣栓塞分批處死大耳白兔。電鏡液固定損傷脊髓部位，取3 mm長，損傷脊髓用10%的中性福爾馬林固定液再固定，常規(guī)石蠟包埋切片，經(jīng)He常規(guī)染色后鏡下觀察出血、壞死、炎性滲出情況，每組篩選3～5個陽性反應(yīng)顯著標(biāo)本行免疫組化染色分析。

　　1.3.2　主要試劑

　　兔抗兔bFGF單克隆抗體、SP免疫組織化學(xué)試劑盒，DAB顯色劑(由武漢博士德生物工程有限公司提供)。

　　1.3.3　bFGF免疫組化染色

　　①石蠟切片常規(guī)脫蠟至水;②10%過氧化氫37℃孵育10 min，微波抗原修養(yǎng);③羊血清孵育10 min，滴加-抗4℃過夜;④滴加二抗37℃孵育30 min;⑤滴加三抗37℃孵育30 min;⑥D(zhuǎn)AB顯色蘇木素復(fù)染;⑦脫水透明封片。

　　1.4　圖象分析和統(tǒng)計處理

　　應(yīng)用美國產(chǎn)Optimas 6.51彩色圖象分析系統(tǒng)(湖南中醫(yī)學(xué)院診斷所提供)在10×40倍視野光學(xué)顯微鏡下對bFGF免疫組織化學(xué)染色陽性反應(yīng)物進(jìn)行定量檢測，分別拍攝并測定損傷脊髓灰質(zhì)，(前、后角，灰質(zhì)聯(lián)合共5個視野)和白質(zhì)(前后索側(cè)索共6個視野)灰、白質(zhì)共11個視野陽性信號數(shù)和灰度(Mean Gray)。用SPSS.11.5統(tǒng)計軟件進(jìn)行方差分析，P<0.05視為有顯著性差異[3]。

　　2　結(jié)果

　　2.1　免疫組織化學(xué)染色顯微鏡下結(jié)果，見下圖。

　　2.2　針灸組、模型組圖象灰度與陽性信號數(shù)變化對比分析

　　見表1-3，動態(tài)變化見表4。表1　脊髓灰、白質(zhì)6 h時相變化表2　脊髓灰、白質(zhì)7 d時相變化　　表3　脊髓灰、白質(zhì)15 d時相變化　表4　脊髓灰、白質(zhì)不同階段的動態(tài)變化

　　數(shù)據(jù)通過方差分析q檢驗得出：模型組白質(zhì)灰質(zhì)各時相灰度無顯著差異(P>0.05)。灰質(zhì)中，造模第7 d時陽性信號數(shù)顯著升高(P<0.05)。白質(zhì)中，于造模第7 d、第15 d出現(xiàn)陽性信號數(shù)升高。針刺組白質(zhì)灰質(zhì)的灰度在第7 d、第15 d升高。陽性信號數(shù)6 h顯著高于7 d時，并于第7 d出現(xiàn)陽性信號低谷，差異顯著(P<0.05)。15 d時又升高，基本同于正常組。針灸第7 d時，灰白質(zhì)灰度均顯著升高，信號數(shù)顯著下降，為控制瘢痕形成，減少粘連創(chuàng)造了有利條件。為治療損傷修復(fù)進(jìn)入關(guān)鍵階段。針灸組灰白質(zhì)比較：6 h、15 d時陽性信號數(shù)白質(zhì)明顯高于灰質(zhì)。

　　3　討論

　　bFGF，在截癱損傷過程中參與神經(jīng)元保護(hù)與修復(fù)及促進(jìn)突觸再生的作用已被證實[4]。有研究表明，中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷局部環(huán)境存在自我修復(fù)因素，多種生長因子表現(xiàn)為短暫性升高[5]。同樣，當(dāng)脊髓發(fā)生損傷時，脊髓組織細(xì)胞外基質(zhì)中的bFGF被大量激活，以誘導(dǎo)毛細(xì)血管生長、引起炎性細(xì)胞介質(zhì)的聚集，通過促進(jìn)細(xì)胞的有絲分裂，來促使成纖維細(xì)胞的增殖。從而，有bFGF參與形成的瘢痕組織便成為了神經(jīng)細(xì)胞再生的障礙之一。在本研究中，可以見到在不完全性截癱兔模型造模后第7 d bFGF的陽性表達(dá)出現(xiàn)顯著升高，在第15 d時稍有回落，神經(jīng)原細(xì)胞水腫明顯，并可見炎性浸潤、血管組織增生，表明bFGF的表達(dá)與脊髓的繼發(fā)性損傷密切相關(guān)。7 d時為神經(jīng)組織瘢痕形成期，模型組7 d顯著升高，說明bFGF既是促進(jìn)神經(jīng)元保護(hù)修復(fù)的因素，又是形成瘢痕的因素之一。

　　從截癱的治療方法來看，現(xiàn)代應(yīng)用于臨床的主要是手術(shù)及康復(fù)治療。截癱手術(shù)，如“脊髓斷端縫合術(shù)”、“神經(jīng)根脊髓植入術(shù)”、“肋間神經(jīng)馬尾神經(jīng)吻合術(shù)”等，手術(shù)難度大，術(shù)后的瘢痕粘連是手術(shù)成功率小的主要原因，手術(shù)創(chuàng)傷大，術(shù)后仍須進(jìn)行長時間的康復(fù)治療，臨床上不能被普遍接受和采用。至于康復(fù)治療，西醫(yī)主要靠神經(jīng)組織自身的功能“蘇醒”及功能鍛煉，亦未取得明顯療效。近年來，針灸作為康復(fù)手段治療截癱取得了一定進(jìn)展，療效卓著，具有很好的臨床應(yīng)用前景。然而，針灸作用機(jī)理還遠(yuǎn)未被闡明。已有研究表明，針灸作用于神經(jīng)損傷的途徑之一可能是與減輕或抑制了bFGFmRNA的表達(dá)有關(guān)[6]。本實驗采用免疫組織化學(xué)方法檢測了針灸作用于截癱模型的bFGF動態(tài)表達(dá)。結(jié)果顯示，針灸治療組bFGF陽性表達(dá)主要表現(xiàn)在脊髓白質(zhì)部位，6 h顯著增高為第一高峰，是截癱形成自身保護(hù)、自我修復(fù)因素的良好信號。損傷第7 d出現(xiàn)bFGF陽性信號數(shù)明顯降低，呈現(xiàn)一個低谷，與模型組7天達(dá)到最高峰相反。與光鏡下神經(jīng)原細(xì)胞水腫等炎性表現(xiàn)明顯較模型組減輕相一致，提示針灸作用于截癱早期脊髓損傷的機(jī)理與對內(nèi)源性bFGF的抑制有關(guān)。針灸通過作用于受損的脊髓組織抑制bFGF在體內(nèi)的合成，減輕了其促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖的作用，減少炎性細(xì)胞聚集，從而抗瘢痕抗粘連有利于神經(jīng)營養(yǎng)物質(zhì)順利通過及與神經(jīng)再生創(chuàng)造良好條件，減輕脊髓繼發(fā)性損傷，為截癱的恢復(fù)提供了有利條件。針灸作用于脊髓bFGF表達(dá)的時相變化，可為針灸治療截癱的臨床研究機(jī)理探討提供參考依據(jù)。

　　【參考文獻(xiàn)】

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　　3　賀石林，等.中醫(yī)科研設(shè)計與統(tǒng)計學(xué)[M].長沙：湖南科學(xué)技術(shù)出版社，2003.331-332.

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　　6　劉世敏，等.不同針灸療法對頸椎椎間盤退變模型大鼠bFGFmRNA表達(dá)的影響[J]上海針灸雜志，2003,22(11)：25-27.

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