摘要：為探討分離自患病刺參(Apostichopus japonicus)的一株溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)感染刺參后，刺參體腔細(xì)胞免疫相關(guān)基因的響應(yīng)變化，分別給刺參注射100 μL生理鹽水(對照組)和1×109 CFU/mL溶藻弧菌菌液(實驗組)，用熒光定量PCR技術(shù)，檢測24 h內(nèi)刺參體腔細(xì)胞Lys、Rel和p105基因表達(dá)的變化。結(jié)果表明，注射生理鹽水對刺參體腔細(xì)胞Lys、Rel和p105基因表達(dá)量無顯著影響。感染溶藻弧菌后，實驗組刺參體腔細(xì)胞中溶菌酶基因的表達(dá)量在24 h顯著升高，且1 h和24 h時的表達(dá)量顯著高于對照組(P<0.05);刺參體腔細(xì)胞中p105基因在感染后表達(dá)量呈上升趨勢，3 h達(dá)到峰值，在3 h和6 h，p105基因的表達(dá)量顯著高于對照組(P<0.05);刺參體腔細(xì)胞Rel基因表達(dá)量在感染后無顯著變化。可見刺參感染溶藻弧菌后其體腔細(xì)胞Lys和p105基因的表達(dá)在短時間內(nèi)迅速響應(yīng)。

　　關(guān)鍵詞：刺參(Apostichopus japonicus);溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus);體腔細(xì)胞;基因表達(dá)

　　溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)屬于弧菌科，弧菌屬，革蘭氏陰性菌，是一種常見的海洋致病菌，對魚、蝦、貝等海水養(yǎng)殖動物都有較強(qiáng)的致病性[1-4]。溶藻弧菌會在侵襲和增殖過程中對機(jī)體造成細(xì)胞和組織損傷以及其代謝產(chǎn)物干擾和破壞機(jī)體的局部或全身的正常新陳代謝或機(jī)能[3-5]。盧芷程等[5]的研究結(jié)果表明溶藻弧菌感染凡納濱對蝦后會啟動其免疫機(jī)制并產(chǎn)生活性氧(ROS)和一氧化氮(NO)以對抗病原菌入侵，隨感染時間的延長抗氧化系統(tǒng)會被激活。李晶晶等[6]在研究中也表明凡納濱對蝦感染溶藻弧菌后，需要不斷保持較高的免疫水平，其體內(nèi)的3種Toll樣受體(Toll-like receptors)基因在血淋巴與鰓中的表達(dá)量均顯著升高。溶藻弧菌也是刺參病害的主要致病菌之一[7]，但關(guān)于其對刺參免疫的研究較少。刺參體腔細(xì)胞在刺參非特異性免疫中起著非常重要的作用，是其最基本的防御武器[8]。溶菌酶是刺參體腔細(xì)胞重要的免疫抗菌蛋白，其活性是表征機(jī)體對細(xì)菌性病原抵抗能力的重要指標(biāo)[9]。核因子κB(NF-κB)信號通路是先天性免疫中最為重要的途徑，Rel、p105是該信號通路上重要的轉(zhuǎn)錄因子，同時Rel、p105基因已在刺參上被成功克隆到序列[10]。因此本研究聚焦刺參體腔細(xì)胞的非特異性免疫，選取刺參體腔細(xì)胞溶菌酶(Lys)、Rel、p105基因為目標(biāo)基因，探討刺參體腔細(xì)胞對溶藻弧菌(從患病刺參體壁分離)刺激后24 h內(nèi)Lys、Rel、p105免疫基因的響應(yīng)，為進(jìn)一步探究刺參抵抗溶藻弧菌感染的免疫機(jī)理提供基礎(chǔ)參考。

　　1材料與方法

　　1.1實驗動物

　　實驗所用刺參購買于東方海洋生物科技有限公司。選取平均體重為3 g的健康刺參200頭，暫養(yǎng)于連續(xù)充氣的水箱中，常規(guī)養(yǎng)殖管理，暫養(yǎng)1周。實驗開始前將刺參分為實驗組與對照組。

　　1.2實驗菌株

　　實驗菌株分離自患病刺參，經(jīng)16S rDNA鑒定為溶藻弧菌。使用2216E培養(yǎng)基，28 ℃對其進(jìn)行液體培養(yǎng)，培養(yǎng)過夜后，離心(6 000 r/min，10 min，4 ℃)收集菌體，菌體用0.85%的生理鹽水重懸，將細(xì)菌濃度調(diào)節(jié)至1×109 CFU/mL備用。

　　1.3溶藻弧菌的急性感染與樣品采集

　　注射實驗開始前，取18頭刺參，每6頭刺參的體腔細(xì)胞混在一起，作為一個重復(fù)，即為0時刻的樣本。對照組每頭刺參體壁注射0.1 mL生理鹽水，多點注射。實驗組每頭刺參體壁注射0.1 mL濃度為1×109 CFU/mL的溶藻弧菌菌液，多點注射。注射后分別在1、3、6、12、24 h取樣，每個時刻隨機(jī)取18頭刺參，解剖刺參獲取刺參的體腔液，每6頭刺參的體腔液混合在一起作為一個重復(fù)樣本，每一時刻三個重復(fù)。體腔液轉(zhuǎn)入離心管中，4 000 r/min，4 ℃離心，去上清，每管體腔細(xì)胞加入1 mL TransZolTM Up(北京全式金)，并用槍反復(fù)吹吸，使體腔細(xì)胞裂解，液氮速凍，轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱保存，用于體腔細(xì)胞RNA的提取。

　　1.4免疫相關(guān)基因表達(dá)量的測定

　　1.4.1刺參體腔細(xì)胞RNA的提取取-80 ℃保存的刺參體腔細(xì)胞，按照TransZolTM Up Plus RNA Kit (北京全式金)試劑盒說明提取RNA。用1.5% 瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA是否被降解;用微量紫外分光光度計檢測RNA的濃度。RNA-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

　　1.4.2cDNA的合成和熒光定量PCR使用TransScript Green Two-Step qRT-PCR SuperMix (北京全式金)試劑盒對刺參體腔細(xì)胞RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。向無RNAase的PCR管中依次加入500 ng模板RNA、4 μL 5×TransScript All-in-One SuperMix for qPCR、1 μL gDNA Remover，補(bǔ)足RNase-free Water 至20 μL。輕輕混勻，42 ℃孵育15 min。85 ℃加熱5 s。得到的cDNA -20 ℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

　　引物設(shè)計參考Wang等[10]、Yang 等[11]，由上海生物工程有限公司合成，引物序列見表1。按照TransScript Green Two-Step qRT-PCR SuperMix (北京全式金)試劑盒操作說明，進(jìn)行熒光定量PCR。擴(kuò)增反應(yīng)體系如下：Template 1 μL、Forward Primer 0.4 μL、Reverse Primer 04 μL、2×TransStart Top Green qPCR SuperMix 10 μL、dd H2O 8.2 μL。PCR 程序為： 95 ℃ 30 s; 95 ℃ 10 s;56 ℃ 25 s;72 ℃ 25 s，共40個循環(huán)。以Cytb為內(nèi)參基因，基因的相對表達(dá)量以 2-ΔΔ CT法進(jìn)行計算[12]。

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