摘 要：由植原體引起的檳榔黃化病是海南特色經(jīng)濟(jì)作物檳榔種植上的一種毀滅性病害。本研究通過PCR擴(kuò)增測序、序列多重比對和系統(tǒng)發(fā)育分析，對海南部分代表性地區(qū)檳榔致死性病原植原體的序列信息與系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系進(jìn)行檢測分析。結(jié)果表明：本研究檢測的保亭、屯昌、萬寧等海南部分代表性地區(qū)的檳榔黃化植原體的16S rDNA序列一致;BLAST分析表明各株系16S rDNA與16SrI組植原體同源性為100%。序列多重比對分析表明，本研究各檳榔黃化植原體株系與海南苦棟叢枝、長春花綠變、馬松子變?nèi)~、辣椒黃化皺縮、蛇婆子叢枝、細(xì)圓藤叢枝和日本洋蔥黃化、美國翠菊黃化等植原體同源性為100%;與已報(bào)道的海南萬寧、印度、海南三亞的檳榔黃化植原體16S rDNA序列同源性分別為99.9%、99.9%、99.8%。系統(tǒng)發(fā)育分析表明，本研究檳榔黃化植原體與海南苦棟叢枝、長春花綠變、馬松子變?nèi)~、辣椒黃化皺縮、蛇婆子叢枝、細(xì)圓藤叢枝等株系聚于一個(gè)分枝，支持率為100%。此外，在發(fā)病檳榔葉片、花穗、心葉等組織部位均可檢測到植原體。研究結(jié)果表明，海南檳榔黃化植原體與海南苦棟叢枝、長春花綠變、馬松子變?nèi)~、辣椒黃化皺縮、蛇婆子叢枝、細(xì)圓藤叢枝等植原體株系的同源性極高，檳榔黃化病很可能會以這些寄主植物作為病原傳播載體進(jìn)行傳播擴(kuò)散。

　　關(guān)鍵詞：植原體;檳榔黃化病;分子檢測;親緣關(guān)系;傳播載體

　　植原體(phytoplasma)是一類寄生于植物韌皮部通過刺吸式口器昆蟲傳播的植物毀滅性病原菌，1967年由日本學(xué)者土居養(yǎng)二首次發(fā)現(xiàn)[1]。植原體很難從植物或昆蟲寄主中分離純化培養(yǎng)，對其遺傳信息及表達(dá)代謝等了解相對不足，嚴(yán)重制約植原體研究[2-3]。植原體引起的病害寄主種類多、分布范圍廣、危害程度大，對社會經(jīng)濟(jì)、生態(tài)環(huán)境等影響嚴(yán)重，該病害目前尚無有效的治療藥劑，以防為主。海南省植原體病害種類十分豐富，約占我國已鑒定植原體病害的五分之一，海南植原體病害遍及整個(gè)海南島且危害程度嚴(yán)重，給海南省農(nóng)林業(yè)造成巨大損失[4]。海南省受植原體病害影響的作物有檳榔(Areca catechu L.)、花生(Arachis hypogaea)、苦楝(Melia azedarach)、長春花(Catharanthus roseus)、辣椒(Capsicum annuum)、細(xì)圓藤(Pericampylus glaucus)、山黃麻(Trema tomentosa)等海南特色經(jīng)濟(jì)作物或綠化植物，對海南的社會經(jīng)濟(jì)和生態(tài)環(huán)境等造成嚴(yán)重的影響[4-8]，其中檳榔黃化病(areca palm yellow leaf disease， AYL)在海南發(fā)生普遍且嚴(yán)重，影響巨大。

　　檳榔是我國“四大南藥”之首和海南省重要特色經(jīng)濟(jì)作物，具有很高的藥用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。由植原體引起的檳榔黃化病是海南檳榔種植上的一種毀滅性病害，對海南的社會經(jīng)濟(jì)和生態(tài)環(huán)境造成嚴(yán)重影響。海南檳榔黃化病于1981年首次發(fā)現(xiàn)于屯昌縣，目前已由發(fā)病初期的屯昌縣蔓延至海口、文昌、瓊海、萬寧、陵水、瓊中、定安、樂東、保亭、三亞、五指山等多個(gè)市(縣)[4， 9]。金開璇等[10]通過超薄電鏡切片在檳榔黃化病染病組織中觀察到了植原體。車海彥[4]、羅大全等[11]、通過超薄電鏡切片觀察、四環(huán)素注射處理、PCR擴(kuò)增檢測等技術(shù)進(jìn)一步證實(shí)植原體是海南檳榔黃化病的病原。近年來，在海南不同檳榔種植區(qū)均有不同程度的發(fā)生，且發(fā)病地區(qū)及面積仍在不斷擴(kuò)大，嚴(yán)重影響海南檳榔產(chǎn)業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展[4， 9]。目前，海南植原體病害的發(fā)生傳播、擴(kuò)散流行等問題尚不清楚，海南不同縣(市)、不同生境、不同發(fā)病區(qū)植原體的來源、傳播途徑等問題尚不明確，這些問題嚴(yán)重制約海南相關(guān)植原體病害的防控管理。

　　本研究對海南不同代表性地區(qū)的檳榔黃化病進(jìn)行調(diào)查，采集檳榔黃化病及疑似植原體引起的其他植物病害樣品，通過PCR擴(kuò)增檢測、序列多重比對、系統(tǒng)發(fā)育分析等技術(shù)方法，從分子水平上對海南檳榔黃化植原體進(jìn)行檢測鑒定，豐富對檳榔黃化植原體分子水平上的認(rèn)知。對本研究中檳榔黃化植原體與前期已報(bào)道的檳榔黃化植原體及親緣關(guān)系或地理分布密切相關(guān)的植原體株系間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系進(jìn)行分析，揭示不同寄主植原體株系間遺傳變異水平和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。為檳榔黃化病在海南的傳播擴(kuò)散、流行監(jiān)測和科學(xué)防控等研究提供科學(xué)參考，以促進(jìn)海南該類病害防控理念的發(fā)展與提升。

　　1 材料與方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 樣品采集 實(shí)驗(yàn)材料于2019—2020年采自海南保亭、屯昌、萬寧等地疑似檳榔黃化植原體引起的檳榔黃化病植株，每個(gè)地點(diǎn)采集3份葉片樣品;針對同一株發(fā)病檳榔，采集葉片、花穗、心葉、莖皮、根等不同組織部位，每個(gè)組織部位采集3份樣品，同時(shí)采集健康的檳榔樣品作為對照，用作陽性對照的泡桐叢枝植原體樣品取自中國林業(yè)科學(xué)研究院，所采樣品低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

　　1.1.2 試劑 植物基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)、2×PCR Master Mix預(yù)混液、50×TAE、SYBR Green I染料、6×Loading Buffer、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000購自天根生化科技(北京)有限公司，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。PCR擴(kuò)增引物由生工生物(上海)工程股份有限公司合成。

　　1.2 方法

　　1.2.1 總DNA提取 葉片、花穗、心葉、莖皮、根等樣品取樣量均為0.1 g，利用CTAB法提取染病檳榔組織中的總DNA，植原體總DNA提取方法參考天根植物基因組DNA提取試劑盒說明書方法。

　　1.2.2 PCR擴(kuò)增測序 檳榔黃化植原體通過植原體通用引物R16mF2/R16mR1、R16F2n/R16R2[2]進(jìn)行擴(kuò)增。用引物R16mF2/R16mR1擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物稀釋50倍后用作引物R16F2n/R16R2進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增的模板，引物序列信息見表1。PCR反應(yīng)體系和條件如下：PCR反應(yīng)體系為25 μL，包括1.0 μL DNA模板，1.0 μL上游引物和下游引物(10 μmol/L)，12.5 μL 2×PCR Master Mix(包含0.05 U/μL Taq DNA聚合酶，4 mmol/L MgCl2和0.4 mmol/L dNTPs)，用ddH2O補(bǔ)至25 μL。反應(yīng)條件為94.0 ℃，5 min;94.0 ℃，30 s，53.0 ℃，40 s，72.0 ℃，1 min 30 s(直接PCR)或1 min 20 s(巢式PCR)，共35個(gè)循環(huán);72.0 ℃，10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用SYBR Green I染色、經(jīng)1.0%(w/V)瓊脂糖凝膠、凝膠成像系統(tǒng)檢測。相關(guān)PCR擴(kuò)增引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠檢測，有明顯目的條帶的擴(kuò)增產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。本研究所得核苷酸序列均上傳至GenBank數(shù)據(jù)庫。