摘 要：初步探究凹線仙女蜆的系統(tǒng)發(fā)育地位，為凹線仙女蜆的分子遺傳學(xué)研究提供前期數(shù)據(jù)。采用PCR方法擴(kuò)增得到凹線仙女蜆Cyrenobatissa subsulcata線粒體細(xì)胞色素b(Cytb)基因片段序列，序列長(zhǎng)為624 bp，并在NCBI上使用NT數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行Blast比對(duì)分析，進(jìn)而構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，探討凹線仙女蜆的分類地位。結(jié)果顯示NT數(shù)據(jù)庫(kù)中未見(jiàn)凹線仙女蜆的Cytb基因信息。研究擴(kuò)增獲得的序列與蜆屬其他種的Cytb基因片段有88%的相似性，與其他簾蛤目貝類的相似度77.02%～78.53%，表明擴(kuò)增出的片段是凹線仙女蜆?biāo)赜械腃ytb基因片段。基于Kimura′s 2-Parameter模型計(jì)算得出，3個(gè)樣本個(gè)體的遺傳距離僅為0～0.0016，遠(yuǎn)小于蜆屬內(nèi)種間遺傳距離(0.002～0.114)，與蜆屬的遺傳距離為0.127～0.144、與簾蛤目簾蛤科種類遺傳距離為0.282～0.335。進(jìn)化樹(shù)顯示，凹線仙女蜆樣品獨(dú)立聚為一支，與蜆屬聚為一大支，支持度為99，表明仙女蜆屬與蜆屬的親緣關(guān)系較近，與簾蛤科的遺傳距離較遠(yuǎn)。

　　關(guān)鍵詞：凹線仙女蜆;Cytb基因片段;進(jìn)化樹(shù);遺傳距離

　　凹線仙女蜆Cyrenobatissa subsulcata隸屬于軟體動(dòng)物門(mén)Mollusca、雙殼綱Bivalvia、異齒亞綱Heterodonta、簾蛤目Veneroida、蜆科Corbiculidae、仙女蜆屬Cyrenobatissa。凹線仙女蜆是中國(guó)的地方性物種，分布具有局限性，主要棲息于底質(zhì)為沙或沙泥的咸淡水交匯處，主要分布于廣東省(汕頭韓江、吳川鑒江)、廣西省(防城)、海南省(排港)和臺(tái)灣省(淡水、蘇澳、安平)[1]。蜆科種類在沿海河口半咸水區(qū)域也有較多分布，硬殼蜆屬的紅樹(shù)蜆Polymesoda erosa分布于中國(guó)、菲律賓等地區(qū)，我國(guó)主要分布于廣東省、廣西省、海南省、臺(tái)灣地區(qū)等[2];花蜆屬的花蜆Cyrenodonax formosana分布于河口砂質(zhì)區(qū)，產(chǎn)于我國(guó)臺(tái)灣地區(qū)(淡水)、福建省(云霄)和廣西省(防城)[3];蜆屬的河蜆廣泛分布于江河、湖泊、溝渠及咸淡水交匯處等水域，在福建省的閩江、烏龍江地區(qū)有百年的養(yǎng)殖歷史，是河口底棲生物的重要組成部分和重要的經(jīng)濟(jì)貝類[4-5]。

　　凹線仙女蜆的研究主要在分類學(xué)和生態(tài)學(xué)[6]，對(duì)河蜆Corbicula fluminea等蜆科物種研究較多，包括生態(tài)特性、遺傳差異分析、生長(zhǎng)與繁殖等方面[7-9]。凹線仙女蜆是蜆科中個(gè)體最大的物種，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[6]。蜆的軟體部含有較低的脂肪、較高的蛋白質(zhì)，蜆肉酶解產(chǎn)物具有解酒護(hù)肝的功效，可食用也可作為天然調(diào)味品，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[10]。由于過(guò)度捕撈等一系列對(duì)自然環(huán)境的不合理利用問(wèn)題，造成河流生態(tài)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)破壞、生物多樣性驟減和生態(tài)系統(tǒng)生產(chǎn)力下降，有些地區(qū)的蜆類已處于瀕危狀態(tài)，制約了蜆類產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[11-13]。因此，對(duì)凹線仙女蜆?lè)N質(zhì)資源的保護(hù)、利用研究已顯得十分緊迫。物種的分子鑒定是種質(zhì)資源研究的重要基礎(chǔ)，細(xì)胞色素b基因(Cytb)作為一種線粒體DNA分子標(biāo)記，其結(jié)構(gòu)和功能是線粒體DNA的13個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因中了解最清楚的基因，已廣泛用于魁蚶Scapharca broughtonii、鰱Hypophthalmichthys molitrix、松江鱸Trachidermus fasciatus和河蜆Corbicula fluminea等水生物種的分子鑒定、種間變異程度和親緣關(guān)系、不同地理群體遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)等研究[14-19]，但目前尚未見(jiàn)凹線仙女蜆線粒體基因研究的相關(guān)報(bào)道。

　　本研究以分布于福州市長(zhǎng)樂(lè)區(qū)凹線仙女蜆群體為研究對(duì)象，對(duì)其Cytb基因片段進(jìn)行擴(kuò)增分析，探討Cytb基因片段作為凹線仙女蜆?lè)N類鑒定的分子標(biāo)記的可行性，可為凹線仙女蜆的遺傳多樣性、種質(zhì)資源研究提供基礎(chǔ)資料。

　　1 材料與方法

　　1.1 試驗(yàn)材料

　　1.1.1 凹線仙女蜆樣本信息 凹線仙女蜆Cyrenobatissa subsulcata個(gè)體全部取自福州市長(zhǎng)樂(lè)區(qū)文武砂鎮(zhèn)規(guī)劃中的濱海新區(qū)濕地公園(圖1)。

　　1.1.2 試驗(yàn)儀器 PCR儀、凝膠成像分析系統(tǒng)、Nanodrop分光光度計(jì)、體視熒光顯微鏡、電泳儀、解剖鏡。

　　1.1.3 試驗(yàn)試劑 蛋白酶K、Quick-DNA Universal Kit 試劑盒(Zymo Research生物科技公司)、瓊脂糖(Sigma-Aldrich)、引物(福州擎科生物技術(shù)有限公司合成)、 DNA marker(Thermo Scientific)、 PCR mixture(北京全式金生物技術(shù)有限公司)。

　　1.2 試驗(yàn)方法

　　1.2.1 形態(tài)學(xué)性狀測(cè)定 從采集來(lái)的凹線仙女蜆中隨機(jī)挑選30個(gè)，將貝殼表面的水分吸干后，用游標(biāo)卡尺測(cè)量仙女蜆的殼長(zhǎng)、殼高、殼寬，精確到0.01 mm。用電子天平測(cè)量活體的軟體重、殼重、總重精確到0.01 g。凹線仙女蜆的外部形態(tài)見(jiàn)圖2。

　　1.2.2 凹線仙女蜆基因組DNA的提取 采用Quick-DNA Universal Kit試劑盒提取基因片段，在所選的30個(gè)凹線仙女蜆中隨機(jī)挑選3個(gè)個(gè)體，分別提取，每個(gè)個(gè)體取0.1 g的肌肉組織放入EP管，剪碎后加入95 μL無(wú)菌水、95 μL Solid Tissue Buffer(blue)和10 μL蛋白酶K。將EP管放入55℃的水浴鍋中水浴1.5 h。當(dāng)組織溶解后，12000 r·min-1離心10 min，取上層液150 μL，移入新的EP管，加300 μL的Genomic Binding Buffer溶液混合均勻。混合液轉(zhuǎn)入Zymo-spin IIC-xl小管中，12000 r·min-1離心1 min，棄掉下管的液體。再加 400 μL的DNA pre-wash Buffer到小管，12000 r·min-1離心1 min。然后加700 μL的g-DNA wash Buffer液體到小管，12000 r·min-1速度下離心1 min，棄掉下管的液體。最后加入37 μL雙蒸水。12000 r·min-1離心1 min后得到DNA溶液，之后進(jìn)行電泳，并用Nanodrop測(cè)定DNA完整度和純度。

　　1.2.3 凹線仙女蜆Cytb基因片段的克隆和序列測(cè)定 Cytb基因引物設(shè)計(jì)參考Yamada等[20]，序列擴(kuò)增通用引物為CBF6(5′GCAAGCTTTTGATTCTGTTGTTCACATTG3′)和CBR6(5′GTAGGAATCCTACGCAAAATGAGAATAAGCG3′ )。據(jù)梯度PCR確定最適溫度57℃，在此溫度下進(jìn)行PCR產(chǎn)物的大體系擴(kuò)增。PCR 100 μL體系如下：模板DNA 2 μL、上下游引物1 μL、2×PCR mixture 50 μL和無(wú)菌水46 μL。分別以3只凹線仙女蜆基因組DNA作模板，放入PCR儀擴(kuò)增。擴(kuò)增程序?yàn)椋侯A(yù)變性94℃ 7 min，變性94℃ 1 min，復(fù)性57℃ 45 s，72℃延伸2 min，擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)結(jié)束后，72℃再延伸7 min。預(yù)期擴(kuò)增片段大小640 bp，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%的凝膠電泳，選擇亮度完好、有特異性條帶的PCR產(chǎn)物送到尚亞生物公司測(cè)序。

　　1.3 數(shù)據(jù)分析

　　運(yùn)用Excel對(duì)形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行初步處理，計(jì)算變異系數(shù)。利用Mega7軟件將本研究得到的基因片段在NCBI上使用NT數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行Blast比對(duì)和序列信息分析。運(yùn)用Mega7軟件內(nèi)Clustal W進(jìn)行多序列比對(duì)，并輔以人工校對(duì)，計(jì)算出凹線仙女蜆Cytb基因片段序列長(zhǎng)度以及堿基組成;通過(guò)Kimura′s 2-Parameter模型計(jì)算出凹線仙女蜆與蜆屬的其他種Cytb基因片段序列的遺傳距離;通過(guò)Maximum Likelihood方法對(duì)凹線仙女蜆Cytb基因片段進(jìn)行分子進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建。

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