摘 要：棗瘋病是棗樹上由植原體引起的一種毀滅性病害，但有關棗瘋病植原體與寄主根部內(nèi)生細菌間的相關性鮮有研究。本試驗采用常規(guī)分離培養(yǎng)方法從春季冬棗根部分離純化內(nèi)生細菌，通過PCR擴增出內(nèi)生細菌16S rRNA基因的DNA片段，測序后利用NCBI中的BLAST軟件進行序列同源性比對，對健康和感病冬棗樹根部可培養(yǎng)內(nèi)生細菌進行統(tǒng)計，根據(jù)二者對比結果初步判斷植原體對冬棗根部可培養(yǎng)內(nèi)生細菌菌群的影響。

　　結果表明，健康冬棗樹分離出18個菌株，鑒定出6個屬(除2個僅鑒定到科水平外)的內(nèi)生細菌，包括芽孢桿菌屬(Bacillus)6株、假單胞菌屬(Pseudomonas)5株、寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonas)2株、金黃桿菌屬(Chryseobacterium)1株、志賀氏菌屬(Shigella)1株、埃希氏菌屬(Escherichia)1株;感病冬棗樹分離出17個菌株，鑒定出2個屬的內(nèi)生細菌，分別為芽孢桿菌屬(Bacillus)10株和假單胞菌屬(Pseudomonas)7株;感病冬棗樹根部可培養(yǎng)內(nèi)生細菌菌群屬水平較健康冬棗樹減少4個屬，說明棗瘋病導致冬棗根部內(nèi)生細菌菌群在屬水平上的降低。

　　關鍵詞：棗瘋病;內(nèi)生細菌;16S rRNA基因

　　棗(Ziziphus jujube Mill)是鼠李科棗屬植物，屬于溫帶落葉小喬木，生長于海拔1 700 m以下的山區(qū)、丘陵或平原，適應性強、種植范圍廣，是我國特色優(yōu)勢果樹和第一大干果樹種，在我國農(nóng)業(yè)經(jīng)濟中具有重要地位。據(jù)記載，我國棗樹的種植栽培已有3千～4千年的歷史，棗樹資源豐富，品種優(yōu)良[1]。棗瘋病是一種由植原體引起的高致死傳染性病害，幾乎分布于國內(nèi)外所有棗樹分布區(qū)，且絕大多數(shù)早熟品種對其敏感，棗樹一旦染病，通常幼樹1～2年、成齡樹3～5年即逐漸枯死，早在1951年，我國很多地區(qū)就發(fā)現(xiàn)有棗瘋病危害，現(xiàn)仍是棗業(yè)發(fā)展的一大障礙[2]。

　　植原體最早是在桑樹萎縮病等病株的篩管切片中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)相關學者系統(tǒng)地比較研究，確定了棗瘋病是由植原體感染引起，而不是病毒或病毒與植原體復合侵染所造成的結果，而關于植原體引起黃化的作用機制主要是其在篩管細胞中大量增殖引起阻塞所致[3-4]。劉棟等[5]通過對發(fā)病葉片組織結構比較分析，結果揭示了棗瘋病發(fā)病后葉片的細胞結構發(fā)生變化，如細胞數(shù)量減少、排列紊亂，甚至某些特殊結構缺失等。

　　棗瘋病防治相關研究主要集中在抗棗瘋病新品種品系的選育、藥物治療等方法，但新品種需要較長時間，而且抗病性易被克服，藥物治療持續(xù)時間短，易復發(fā)[6-7]。植物內(nèi)生菌(Endophyte)是植物組織內(nèi)的正常菌群，也是植物微生態(tài)系統(tǒng)中的天然組成成分，不僅包括互惠共利和中性的內(nèi)共生微生物，而且包括潛伏在宿主體內(nèi)的病原微生物[8]。作為一種新的生物資源，植物內(nèi)生菌可通過多種途徑抑制病原菌生長，達到防治病害的目的，例如產(chǎn)生抗生素類、水解酶類、植物生長調(diào)節(jié)劑和生物堿類物質(zhì)，與病原菌競爭營養(yǎng)物質(zhì)，增強宿主植物的抵抗力以及誘導植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗性等，故可用于防治植物病害，尤其是化學防治較為困難的植物病害[9-10]。但目前尚未有關于棗瘋病植原體與寄主根部內(nèi)生細菌間相關性研究，鮮有針對于棗瘋病植原體生物防治方面的研究。

　　本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)春季棗瘋病植原體主要從根部組織通過維管束組織進入植株上部幼嫩組織如幼芽和葉片中[5]。根部是植原體主要過冬場所，因此，本研究采集健康及染棗瘋病的冬棗樹根部組織，對內(nèi)生細菌進行分離、純化、培養(yǎng)及形態(tài)和分子鑒定，研究健康及染棗瘋病的冬棗樹根部內(nèi)生菌種類多樣性，為冬棗病害防治提供研究基礎。

　　1 材料和方法

　　1.1 試驗材料

　　試驗材料取自天津農(nóng)學院東校區(qū)棗園，在同地塊中選取健康冬棗樹和感染棗瘋病冬棗樹，每3株植株根部組織合并為1個樣品，分別將健康冬棗樹(Z)和感染棗瘋病冬棗樹(B)的根部清洗干凈，置于4 ℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

　　1.2 試驗方法

　　1.2.1 內(nèi)生細菌的分離純化 先將健康和感染棗瘋病的冬棗樹根部組織用自來水清洗，去除表面的泥土，用濾紙吸干或晾干殘留的水分后，用天平分別稱取0.2 g根部組織。在超凈工作臺下，將根部完全浸泡在75%的乙醇溶液10 min，再用無菌水洗3～4次，將最后1次清洗的水涂布在LB平板上用來檢查滅菌的效果。將表面消毒干凈的根部組織用滅過菌的剪刀剪碎置于無菌研缽中，加入1 mL無菌水充分研磨。將研磨液轉(zhuǎn)移至無菌試管中，1 000 r·min-1離心1 min去除大部分根部組織，取上清液進行梯度稀釋10-1～10-3，每個梯度取100 μL涂布在LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，每個處理重復3次，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)，每天定時觀察菌落的生長狀況。

　　待內(nèi)生菌長出后，根據(jù)菌落的形態(tài)特征分別挑取不同類形的內(nèi)生細菌，在LB固體培養(yǎng)基中用平板劃線法反復純化，直到在平板表面長出單菌落后，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

　　1.2.2 革蘭氏染色 為更好地觀察內(nèi)生細菌的菌體形態(tài)，對內(nèi)生細菌進行革蘭氏染色[11]，通過鏡檢對分離出的內(nèi)生細菌進行初步分類鑒定。

　　1.2.3 內(nèi)生細菌DNA的提取 在超凈工作臺下，在酒精燈5 cm附近將液體LB培養(yǎng)基倒入無菌試管中，用無菌接種針挑取內(nèi)生細菌的單菌落放于試管中，放置于33 ℃的搖床(200 r·min-1)搖培10 h。用Easy Pure Bacteria Genomic DNA Kit試劑盒提取DNA。將最后洗脫的DNA置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

　　1.2.4 PCR擴增16S rRNA的DNA片段 以冬棗樹根部組織分離出內(nèi)生細菌的DNA為模板進行PCR擴增。

　　引物序列為：27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)

　　1 492R(5’-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3’)

　　PCR反應擴增體系見表1。

　　PCR擴增程序見圖1。

　　PCR反應結束后，取3 μL PCR產(chǎn)物與1 μL 6×DNA Loading Buffer混合后加入1.0%瓊脂糖凝膠點樣電泳。待DNA跑至凝膠中央時結束電泳，Goldview染色劑染色10 min，使用凝膠成像系統(tǒng)觀測電泳條帶并攝影記錄。

　　將PCR獲得的產(chǎn)物送至華大基因公司測序，將所得的各個菌株的基因序列測序結果在NCBI (https：//www.ncbi.nlm. nih.gov/)數(shù)據(jù)庫中進行BLAST比對，篩選出與其同源性最高的已知序列，根據(jù)Clarridge[12]提出的16S rRNA基因序列同源性高于99%可確定種，同源性在95%～99%之間可確定屬的原則，初步確定所測菌株的分類地位。

　　2 結果與分析

　　2.1 內(nèi)生細菌的分離結果

　　觀察健康和染病冬棗樹分離出的內(nèi)生細菌(圖2)可以發(fā)現(xiàn)，在涂布了健康和染病冬棗樹菌液的培養(yǎng)皿上，均長出了大量細菌菌落，說明冬棗樹的根部組織存在著豐富的內(nèi)生細菌;從健康冬棗樹和染病冬棗樹根部組織分離出來的內(nèi)生細菌菌落形態(tài)看，健康冬棗樹比染病冬棗樹分離出來的內(nèi)生細菌的豐富度要大;分離得到的內(nèi)生細菌根據(jù)形態(tài)差異進行平板劃線純化，各內(nèi)生菌菌株生長速度和菌落形態(tài)存在差異，經(jīng)過形態(tài)學鑒定和再分離純化，最終獲得正常冬棗樹內(nèi)生細菌18個菌株(Z1～Z18號)，染病冬棗樹內(nèi)生細菌17個菌株(B1～B17號)。

　　2.2 革蘭氏染色結果

　　將分離得到的內(nèi)生細菌進行了革蘭氏染色，對內(nèi)生細菌進行初步分類鑒定，其中紫色為陽性菌，紅色為陰性菌。由革蘭氏染色結果(表2)可知，革蘭氏陽性菌共有16個菌株，革蘭氏陰性菌共有19個菌株;健康植株根部內(nèi)生細菌菌株中12株為革蘭氏陰性菌，6株為革蘭氏陽性菌，而發(fā)病植株根部內(nèi)生細菌菌株中7株為革蘭氏陰性菌，10株為革蘭氏陽性菌。

　　2.3 細菌16S rRNA基因擴增結果

　　將分離出來的內(nèi)生細菌的DNA作為模板，引物以27 F/1 492 R進行PCR擴增，經(jīng)1.0%的瓊脂糖凝膠上點樣電泳。結果(圖3、圖4)顯示，健康冬棗樹和染病冬棗樹都跑出了約為1 500 bp左右的目的條帶，說明PCR擴增出了內(nèi)生細菌的16S rRNA基因的DNA片段。

　　推薦閱讀：《亞熱帶植物科學》(季刊)創(chuàng)刊于1972年，系福建省亞熱帶植物研究所主辦的植物專業(yè)學術性期刊。