摘要：以玉針香/鄂中5號/玉晶91為材料，探討水稻(Oryza sativa L.)花藥培養過程對培養效果的影響。結果表明，以蔗糖為碳源的誘導培養基誘導，低溫預處理8 d效果較好，以麥芽糖為碳源的誘導培養基誘導則預處理10 d達到最好的誘導效果，但總體以麥芽糖為碳源誘導明顯好于以蔗糖為碳源誘導;早取穗和晚取穗都不利于愈傷組織的誘導;以麥芽糖做碳源的誘導培養基誘導出的愈傷組織分化效果較好，分化率較高;同一批材料中，較早誘導出的愈傷組織分化率遠高于后期長出的愈傷組織。

　　關鍵詞：水稻(Oryza sativa L.);花藥培養;誘導率;分化率

　　單倍體植株，1975 年中國利用花藥培養育種技術第1次育成了粳稻品種單豐1 號，標志花培技術在中國常規水稻育種中開始應用。由于花藥培養誘導產生的單倍體，表現出雙親性狀的各種重組類型，通過自然加倍或人工處理加倍，可以在當代獲得穩定的純合二倍體。將花藥培養與常規育種技術相結合，可以快速純合有益基因，提高選擇效率，縮短育種周期[1-6]。截至目前，水稻花藥培養技術逐步完善，并應用于水稻遺傳育種，并成為當今生物技術育種中較為成熟、實用、有效的育種新技術。

　　各開展水稻相關基礎研究的科研單位也由于研究工作的需要，希望能快速得到較大的DH群體或穩定的水稻材料，也很大程度依賴于花藥培養技術。在實際操作過程中，由于受材料的差異性、培養基組分以及培養操作過程等的影響，往往獲得的再生植株群體較小，使育種選擇受到較大的限制或影響后續研究。因此，提高花藥培養的效率，增大花培后代群體，是水稻花培研究人員共同的目標。

　　水稻花培技術已經有幾十年的歷史，但大多數都是針對粳稻，因此粳稻的花藥培養已經相對比較成熟，而秈稻的花培效率一直較低，嚴重影響秈稻花培育種的進程。關于如何提高花藥培養的效率，國內外也有很多的文獻報道，在基本培養基成分、植物生長調節劑種類和配比、低溫預處理等對培養效率的影響方面進行了大量的研究，但培養過程中包括取穗時間對誘導的影響、誘導培養基對分化的影響分化接種階段對分化的影響等研究較少。本試驗通過秈稻材料花培過程中不同誘導培養基條件下取穗時期、取穗后預處理時間、分化接種時間等對花藥培養效果的影響，通過統計不同條件下愈傷組織誘導率或分化率，得到秈稻花藥培養較好的培養條件，為廣大花培工作者提供參考。

　　1 材料與方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 植物材料 所用水稻材料為中稻秈型育種材料玉針香/鄂中五號/玉晶91。

　　1.1.2 培養基 以N6為誘導培養的基本培養基;以MS為分化培養的基本培養基;培養基中所用生長調節劑和脯氨酸濃度單位為mg/L;培養基的pH均為5.8。

　　1.2 方法

　　1.2.1 幼穗取材及低溫預處理 幼穗取材一般于晴天上午10：00前或下午5：00后進行。選取劍葉與下一葉的葉枕距約8 cm的帶苞葉稻穗，此時幼穗的穎殼寬度已接近成熟的大小，穎殼呈現淡綠色，雄蕊伸長達穎殼的1/3～1/2，花藥發育處于單核中晚期。將帶苞葉稻穗用濕潤紗布包裹，裝入保鮮袋后置于冰箱中8 ℃進行低溫預處理8～10 d。

　　1.2.2 花藥接種 無菌臺上剝除稻穗苞葉，選取合適的小穗剪下，用新配制的3%次氯酸鈉溶液浸泡23 min，用無菌水沖洗4～5次，用無菌濾紙吸干水后，采用剪穎抖藥法將花藥接至誘導培養基上，每個三角瓶約接種100個花藥。

　　1.2.3 培養條件 誘導階段均采取28 ℃黑暗培養。

　　1.2.4 統計方法 隨機抽取每種試驗類型誘導的材料10瓶，統計每瓶的誘導率，計算平均值得出該試驗類型的愈傷組織誘導率;不同培養基誘導后的分化率則為隨機抽取每種試驗類型的分化材料10瓶統計分化情況，計算平均值。

　　2 結果與分析

　　2.1 取穗時期對誘導效率的影響

　　采用兩種不同誘導培養基研究取穗時期對誘導的影響，具體結果見表2。2月28日和3月4日取穗低溫處理后，不論是I3還是I7培養基，平均誘導率都低于3月1日和3月3日取穗的誘導率。也就是說過早和過晚取穗誘導效果都會變差。I7誘導率明顯高于I3，最高可比I3提高49%。

　　2.2 預處理時間對誘導效率的影響

　　通過兩種不同成分的誘導培養基來探討低溫預處理時間對誘導率的影響。研究結果如表3所示，不同成分的培養基對預處理時間的要求不同。以I3誘導愈傷組織時，8 ℃條件下預處理8 d達到最高誘導率13.53%;以I7誘導愈傷組織時，則預處理10 d效果最好，達到23.12%，是I3誘導時最高誘導率的1.7倍。

　　2.3 誘導培養基對分化的影響

　　采用兩種不同培養基I3和I7，愈傷組織接種到相同分培養基F1上進行分化。從表4可以看出，I7誘導出的愈傷組織具有較高的綠苗分化率，分化效果較好。

　　2.4 分化接種時間對分化的影響

　　不同培養基誘導出的愈傷組織根據愈傷形成的先后分批接種到分化培養基上。從表4可以看出，最先形成的愈傷組織具有較好的胚性和分化能力，能分化出完整的花培綠色植株。隨著時間推移，較晚形成的愈傷組織分化能力迅速下降，產生綠苗的能力迅速降低。

　　3 討論

　　典型秈稻花藥培養一直被認為是各種水稻類型中培養效果最差的[17，18]，探討花藥培養條件的各種文獻報道也不少。由于水稻花藥培養受基因型的影響太大，因此，很難得出統一的培養培養條件。本研究以玉針香/鄂中5號/玉晶91為研究材料，探討水稻花藥培養過程對培養效果的影響。結果表明，以蔗糖為碳源的誘導培養基誘導，低溫預處理8 d效果較好，以麥芽糖為碳源的誘導培養基誘導則預處理10 d達到最好的誘導效果，但總體以麥芽糖為碳源誘導明顯好于以蔗糖為碳源誘導;早取穗和晚取穗都不利于愈傷組織的誘導;以麥芽糖做碳源的誘導培養基誘導出的愈傷組織分化效果較好，分化率較高;同一批材料中，較早誘導出的愈傷組織分化率遠高于后期長出的愈傷組織。

　　在水稻尤其是秈稻的花藥培養中，有很多文獻報道誘導階段使用麥芽糖作為碳源有較好的效果[6，7，19]。本研究也得出相同的結論，即秈稻花藥培養誘導階段麥芽糖效果明顯好于蔗糖。同時，麥芽糖作為碳源誘導出的愈傷組織具有較好的分化效果。1998年，丁世萍等[20]分析組織培養過程中麥芽糖作碳源優于蔗糖的可能原因：作為營養物，麥芽糖可在麥芽糖酶作用下分解為葡萄糖，也可在麥芽糖磷酸化酶作用下分解為葡萄糖和葡萄糖-1-磷酸;蔗糖分解為葡萄糖和果糖，果糖可能對培養物有害。

　　從偏秈材料的低溫預處理來看，9 ℃處理7～10 d有利于提高花藥愈傷組織誘導頻率[21]，少有研究針對不同誘導培養基探討低溫預處理時間。本研究則發現8 ℃條件下，如果使用I3培養基即用蔗糖作為碳源誘導愈傷組織，處理8 d能達到最高的誘導率，而如果選用I7培養基即用蔗糖作為碳源誘導愈傷組織，處理10 d能達到最高的誘導率。這可能與麥芽糖有較好的調節滲透壓作用有關。

　　參考文獻：

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　　[7] 孫宗修，斯華敏，程式華.麥芽糖提高水稻花培效率的研究[J].中國水稻科學，1993，7(4)：227-231.

　　推薦閱讀：《雜交水稻》是國家雜交水稻工程技術研究中心和湖南雜交水稻研究中心主辦、對國內外公開發行、專門報道雜交水稻的技術類科技期刊。