摘要：農(nóng)桿菌主要有兩種：根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)和發(fā)根農(nóng)桿菌(Agrobacteriumrhizogenes)。根癌農(nóng)桿菌能在自然條件下趨化性地感染140多種雙子葉植物或裸子植物的受傷部位，并誘導(dǎo)產(chǎn)生冠癭瘤。引發(fā)冠癭瘤的原因是，Ti質(zhì)粒上的T-DNA上有8個(gè)左右的基因在植物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，指導(dǎo)合成一種非常特殊的化合物冠癭堿，進(jìn)而引起轉(zhuǎn)化細(xì)胞癌變。而發(fā)根農(nóng)桿菌則誘導(dǎo)產(chǎn)生發(fā)狀根，其特征是大量增生高度分支的根系。根癌農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒和發(fā)根農(nóng)桿菌的Ri質(zhì)粒上有一段T-DNA，農(nóng)桿菌通過(guò)侵染植物傷口進(jìn)入細(xì)胞后，可將T-DNA插入到植物基因組中。因此，農(nóng)桿菌是一種天然的植物遺傳轉(zhuǎn)化體系，被譽(yù)為“自然界最小的遺傳工程師”[1] 。可以通過(guò)將目的基因插入到經(jīng)過(guò)改造的T-DNA區(qū)，借助農(nóng)桿菌的感染實(shí)現(xiàn)外源基因向植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和整合，然后通過(guò)細(xì)胞和組織培養(yǎng)技術(shù)，得到轉(zhuǎn)基因植物。本文選自：《農(nóng)業(yè)展望》,《農(nóng)業(yè)展望》是由中華人民共和國(guó)新聞出版總署、正式批準(zhǔn)公開發(fā)行的優(yōu)秀期刊。自創(chuàng)刊以來(lái)，以新觀點(diǎn)、新方法、新材料為主題，堅(jiān)持"期期精彩、篇篇可讀"的理念。農(nóng)業(yè)展望內(nèi)容詳實(shí)、觀點(diǎn)新穎、文章可讀性強(qiáng)、信息量大，眾多的欄目設(shè)置，農(nóng)業(yè)展望公認(rèn)譽(yù)為具有業(yè)內(nèi)影響力的雜志之一。農(nóng)業(yè)展望并獲中國(guó)優(yōu)秀期刊獎(jiǎng)，現(xiàn)中國(guó)期刊網(wǎng)數(shù)據(jù)庫(kù)全文收錄期刊。

　　關(guān)鍵詞：農(nóng)桿菌,虎杖莖尖,轉(zhuǎn)化苗,農(nóng)業(yè)展望

　　農(nóng)桿菌介導(dǎo)法起初只被用于雙子葉植物中，近幾年來(lái)，農(nóng)桿菌的介導(dǎo)轉(zhuǎn)化在一些單子葉植物(尤其是水稻)中也得到了廣泛應(yīng)用。此外，生物技術(shù)學(xué)家還可以通過(guò)發(fā)根農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化，在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)高密度的根，作為一種在轉(zhuǎn)基因植物中獲得大量蛋白質(zhì)的方法。

　　1虎杖莖尖對(duì)潮霉素的敏感性

　　本研究以潮霉素作為篩選標(biāo)記,為有效篩選抗性苗,將制備的莖尖分別置于不同濃度梯度的潮霉素培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選,觀察外植體的色澤變化、生長(zhǎng)狀態(tài)和存活情況,試驗(yàn)結(jié)果見表1和圖1。從表1和圖1結(jié)果可以看出,對(duì)照組的虎杖莖尖生長(zhǎng)迅速,并分化出綠色的芽,芽的存活率為95.6%;隨著潮霉素濃度的增高外植體生長(zhǎng)減緩,分化出的芽弱小且存活率逐漸降低至23.7%;高濃度潮霉素處理造成植物組織失綠褐化并迅速死亡。當(dāng)潮霉素濃度在4mg/L以下不能有效抑制非轉(zhuǎn)化細(xì)胞的生長(zhǎng),容易造成大量非轉(zhuǎn)化體的逃逸;潮霉素濃度在15mg/L以上時(shí),外植體迅速死亡將影響轉(zhuǎn)化細(xì)胞的正常生長(zhǎng);而潮霉素濃度8mg/L處理既能有效抑制非轉(zhuǎn)化組織的生長(zhǎng),又不至于造成細(xì)胞迅速死亡,所以潮霉素濃度8mg/L是莖尖轉(zhuǎn)化外植體篩選的適宜濃度。

　　2預(yù)培養(yǎng)時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化的影響

　　將虎杖莖尖分別預(yù)培養(yǎng)1、2、4和8d,侵染菌液濃度OD600值約0.4,侵染莖尖10min,共培養(yǎng)3d,統(tǒng)計(jì)轉(zhuǎn)化后獲得的抗性芽百分率及增殖系數(shù)見表2。結(jié)果表明,適當(dāng)?shù)念A(yù)培養(yǎng)可以提高莖尖的再生分化率。預(yù)培養(yǎng)1d時(shí)的再生分化率較低(2.3%),再生芽生長(zhǎng)細(xì)弱,不利于潮霉素抗性苗的獲得;預(yù)培養(yǎng)2d的莖尖再生分化率最高(4.7%),再生芽生長(zhǎng)健壯;預(yù)培養(yǎng)8d時(shí)的再生分化率反而下降(2.4%)。所以選擇2d作為預(yù)培養(yǎng)的時(shí)間。

　　3菌液濃度對(duì)虎杖遺傳轉(zhuǎn)化的影響

　　將農(nóng)桿菌的濃度OD600稀釋為0.2、0.4、0.6和0.8,侵染預(yù)培養(yǎng)2d的莖尖10min,共培養(yǎng)3d,以轉(zhuǎn)化后獲得的抗性芽百分率及增殖系數(shù)作為評(píng)價(jià)指標(biāo)(表3)。本研究中不同的菌液侵染濃度對(duì)侵染效果的影響顯著。菌液侵染濃度OD600在0.2時(shí)分化率只有2.4%,濃度為0.6時(shí)的分化率達(dá)5.5%,之后隨著濃度的增高分化率降低。故將農(nóng)桿菌菌液濃度稀釋至0.6進(jìn)行侵染。

　　4侵染時(shí)間對(duì)虎杖遺傳轉(zhuǎn)化的影響

　　分別侵染預(yù)培養(yǎng)2d的莖尖5、10、15、20和25min,菌液濃度OD600約0.6,共培養(yǎng)3d,以轉(zhuǎn)化后獲得的抗性芽百分率及增殖系數(shù)作為評(píng)價(jià)指標(biāo)(表4)。經(jīng)10min侵染后的分化率與其他侵染處理都有顯著差異,侵染5、20和25min之間的差異不顯著。侵染10min的再生分化率達(dá)5.3%,增殖系數(shù)較高且再生芽強(qiáng)壯,故將侵染時(shí)間選擇在10min。

　　5共培養(yǎng)時(shí)間對(duì)虎杖遺傳轉(zhuǎn)化的影響

　　用OD600值約0.6的菌液侵染預(yù)培養(yǎng)2d的莖尖10min,分別于黑暗中共培養(yǎng)2、3、4和5d,以轉(zhuǎn)化后獲得的抗性芽百分率及增殖系數(shù)作為評(píng)價(jià)指標(biāo)(表5)。不同共培養(yǎng)時(shí)間對(duì)侵染結(jié)果的影響差異較大,2d時(shí)分化率較低(2.4%),經(jīng)3d共培養(yǎng)后分化率可達(dá)5.6%,但是共培養(yǎng)5d后的分化率又降到2.9%。本試驗(yàn)條件下選擇在侵染后共培養(yǎng)3d較為適宜,有利于獲得較多生長(zhǎng)健壯的抗性再生芽。

　　6虎杖轉(zhuǎn)化苗的獲得

　　虎杖莖尖遺傳轉(zhuǎn)化各階段如圖2所示。剝離好的莖尖經(jīng)預(yù)培養(yǎng)后(圖2-A),進(jìn)行農(nóng)桿菌侵染,并共培養(yǎng)3d(圖2-B);然后轉(zhuǎn)移到篩選培養(yǎng)基上篩選(圖2-C),不具潮霉素抗性的莖尖逐漸褐化死亡;將經(jīng)篩選后成活的莖尖轉(zhuǎn)移到增殖培養(yǎng)基上(圖2-D),促進(jìn)芽增殖與伸長(zhǎng);待幼苗生長(zhǎng)至3-5cm高,轉(zhuǎn)至根誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行生根(圖2-E);最后移栽到盆土中生長(zhǎng)(圖2-F)。

　　7轉(zhuǎn)基因虎杖的PCR檢測(cè)

　　按照上述遺傳轉(zhuǎn)化體系,剝?nèi)』⒄惹o尖300個(gè),經(jīng)農(nóng)桿菌侵染轉(zhuǎn)化、篩選,獲得了移栽成活的抗性植株共15株,潮霉素基因的PCR檢測(cè)(圖3)顯示其中6株為轉(zhuǎn)基因的陽(yáng)性植株,這些轉(zhuǎn)基因植株均含有預(yù)期的約500bp的DNA片段。

　　8轉(zhuǎn)基因虎杖的Southern雜交

　　選取PCR鑒定為陽(yáng)性的轉(zhuǎn)基因虎杖植株,提取葉片基因組DNA,經(jīng)EcoRI酶切、電泳、轉(zhuǎn)膜后以潮霉素基因?yàn)殡s交探針的Southern雜交結(jié)果(圖4)表明,在這6個(gè)株系中均檢測(cè)到雜交條帶,而野生虎杖沒(méi)有雜交信號(hào)。因此,這些轉(zhuǎn)基因虎杖株系的基因組中確實(shí)整合了目的基因。

　　9討論

　　本試驗(yàn)前期采用葉盤法和愈傷組織侵染方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化遇到諸多困難:葉盤經(jīng)過(guò)不同激素組合誘導(dǎo),較難誘導(dǎo)產(chǎn)生不定芽;虎杖是含酚類物質(zhì)較高的藥用植物,其愈傷組織易褐化、難分化成苗。而植物莖尖具有變異性小、有利于保持原有材料的優(yōu)良性狀等特點(diǎn),國(guó)內(nèi)外很多學(xué)者利用莖尖或莖尖分生組織獲得了轉(zhuǎn)基因植株[9-13]。因此,本試驗(yàn)選擇莖尖為轉(zhuǎn)化受體,探討了影響虎杖莖尖遺傳轉(zhuǎn)化的主要因素。潮霉素的毒性機(jī)理是干擾植物細(xì)胞葉綠體和線粒體中的核糖體與延長(zhǎng)因子EF-2的結(jié)合,從而抑制肽鏈的延長(zhǎng)。潮霉素濃度過(guò)低易造成假陽(yáng)性率過(guò)高;潮霉素濃度過(guò)高,可能導(dǎo)致不能得到足量的轉(zhuǎn)基因植株。在對(duì)植物材料進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化之前,對(duì)受體材料進(jìn)行潮霉素敏感性試驗(yàn)是十分必要的。段曉昱等[15]的研究表明向日葵莖尖、子葉、胚軸不同部位轉(zhuǎn)化外植體對(duì)潮霉素敏感性存在一定的差異;大豆品種黑農(nóng)35的子葉節(jié)分化的潮霉素篩選濃度為6mg/L,而叢生芽生根的潮霉素篩選濃度降低為2mg/L[16];可見對(duì)于同一種植物,不同的外植體對(duì)抗生素的敏感性也是不同的。本研究通過(guò)虎杖莖尖對(duì)潮霉素的敏感性試驗(yàn),確定了虎杖莖尖轉(zhuǎn)化的適宜濃度為8mg/L。在連續(xù)篩選過(guò)程中一直使用同一濃度進(jìn)行篩選,這可能是造成轉(zhuǎn)化率低的原因之一。在后續(xù)的研究中可以考察虎杖不同部位外植體對(duì)潮霉素的敏感性,采用梯度添加篩選劑的方式來(lái)提高轉(zhuǎn)化率。在植物遺傳轉(zhuǎn)化中,預(yù)培養(yǎng)可以促進(jìn)細(xì)胞分裂,處于分裂狀態(tài)的細(xì)胞更易整合外源DNA,從而提高轉(zhuǎn)化率;另一方面預(yù)培養(yǎng)能減少褐化現(xiàn)象的產(chǎn)生[17]。趙福永[18]對(duì)含酚類物質(zhì)較高的棉花進(jìn)行了預(yù)培養(yǎng)處理,根誘導(dǎo)階段根誘導(dǎo)率要比對(duì)照組高15%左右。虎杖也是含酚類物質(zhì)較高的植物,本試驗(yàn)中預(yù)培養(yǎng)2d是最佳處理,而預(yù)培養(yǎng)時(shí)間超過(guò)8d,轉(zhuǎn)化率顯著下降。轉(zhuǎn)化率隨著預(yù)培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)先增加后下降,在高粱莖尖轉(zhuǎn)化中也有類似報(bào)道,其原因可能是預(yù)培養(yǎng)時(shí)間過(guò)短莖尖傷口未愈合易受農(nóng)桿菌的侵害;預(yù)培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)莖尖傷口細(xì)胞已不能提供足夠的誘導(dǎo)農(nóng)桿菌貼壁的受體,或由于莖尖分生組織細(xì)胞的分裂速度減緩,進(jìn)入細(xì)胞核的T-DNA量減少[13]。王沛雅等[19]對(duì)河北楊的遺傳轉(zhuǎn)化研究表明,預(yù)培養(yǎng)2d以上可以顯著提高轉(zhuǎn)化率,但預(yù)培養(yǎng)2-8d間的差異不顯著,轉(zhuǎn)化率并不表現(xiàn)出隨著預(yù)培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)先增加后下降的趨勢(shì),說(shuō)明預(yù)培養(yǎng)的時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響可能與所選用植物材料等有關(guān)系。本試驗(yàn)成功建立了虎杖莖尖為轉(zhuǎn)化受體、以潮霉素為篩選劑的根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系,但虎杖莖尖的轉(zhuǎn)化率遠(yuǎn)低于棉花[20]、小麥[9]等作物的莖尖轉(zhuǎn)化效率,所以該遺傳轉(zhuǎn)化體系還有待優(yōu)化。后續(xù)工作可以從農(nóng)桿菌菌株、農(nóng)桿菌介導(dǎo)法結(jié)合漩渦振蕩、真空負(fù)壓處理等方面來(lái)進(jìn)一步優(yōu)化該轉(zhuǎn)化體系。本試驗(yàn)希望通過(guò)提高關(guān)鍵酶基因PcRS在虎杖中的表達(dá)水平,調(diào)控虎杖中白藜蘆醇的生物合成。PCR和Southern雜交檢測(cè),表明外源基因已經(jīng)整合到轉(zhuǎn)基因植株的基因組中。但是本試驗(yàn)只進(jìn)行EcoRI酶的單酶切,還不能準(zhǔn)確確認(rèn)外源基因插入的拷貝數(shù)和位點(diǎn)。在后續(xù)Southern雜交試驗(yàn)中可以采用多個(gè)限制性內(nèi)切酶進(jìn)行單酶切,或者采用雙酶切。另外轉(zhuǎn)基因植株的遺傳穩(wěn)定性、外源基因的表達(dá)、活性成分的含量變化等方面還需要進(jìn)一步深入研究。

　　10結(jié)論

　　采用根癌農(nóng)桿菌EHA105菌株侵染虎杖莖尖較適宜的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)為:預(yù)培養(yǎng)2d,農(nóng)桿菌菌液濃度OD600為0.6,侵染10min,共培養(yǎng)3d,在篩選培養(yǎng)基中添加8mg/L潮霉素,待篩選獲得的抗性芽生長(zhǎng)至3-5cm高,再轉(zhuǎn)至根誘導(dǎo)培養(yǎng)基使其長(zhǎng)成完整植株。利用該體系成功實(shí)現(xiàn)虎杖莖尖遺傳轉(zhuǎn)化白藜蘆醇合酶基因,本研究結(jié)果為拓寬虎杖遺傳轉(zhuǎn)化受體提供了技術(shù)和方法。